Scene 1

3. Claus y col.  estudiaron  la  modulación  de la fosfofructokinasa-1 (PFK-1; 6-fosfofructo-1-kinasa) (2). Los  siguientes   experimentos   constituyen   parte  de  dicho   trabajo .  3.1.  Hepatocitos   aislados  de  ratas   alimentadas  ad libitum se  incubaron   en   presencia  (○) o  ausencia  (●) de glucagon 10  nM   durante  10  minutos .  Posteriormente , las  células  se  homogeneizaron   en  buffer de  fosfato  de  potasio  50 mM, pH 7.5  adicionando   NaF  100 mM, EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol 20 mM y  fenil  metil  sulfonil   fluoruro  (PMSF) 0,1 mM (buffer de  homogenización ) y se  determinó  la  actividad  de PFK-1  en  los  extractos   hepáticos .  En  la  figura  3 se  observa  la  actividad  de PFK-1  en   función  de la  concentración  de  fructosa  6-fosfato y el  efecto  del glucagon  sobre  la  actividad  de la  enzima . Las  flechas   indican  la K0,5.

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Conclusión:  En presencia de glucagón se observa una disminución de la actividad de la PFK-1, dado por una disminución del K0,5 Hipótesis:  El glucagón ejerce un efecto regulador sobre la enzima por fosforilación (directa o indirecta) que culmina en la disminución de la actividad de la misma.

Scene 2

3.2.  En   otro   experimento , los  hepatocitos   aislados  se  resuspendieron   en  buffer Krebs  Henseleit  con bajo  contenido   en   fosfato   adicionado  de 1  mCi  de [32P]PO4 por  gramo  de  hepatocito . La  suspensión   fue   alicuotada  e  incubada   durante  45  minutos  para  permitir  la  incorporación  de 32P al ATP. A  cada   alícuota  se le  agregó  glucagon para  obtener   concentraciones   en  el  rango  0,1-10  nM  y se  incubó   durante  10  minutos .  Posteriormente , las  células  se  homogeneizaron   en  buffer de  homogeneización  y se  midieron  las  actividades  de la PFK-1 y de  piruvato  kinasa (PK).  Para  determinar  la  incorporación  de 32P a la PFK-1 y a la PK se  utilizó  la  técnica  de INMUNOPRECIPITACIÓN. Se  obtuvieron  dos  fracciones   solubles   enriquecidas   en  PFK-1 y PK  respectivamente .  Después  de una  incubación  de 16 horas a 4°C con los  respectivos   antisueros , los  inmunoprecipitados   fueron   colectados  por  centrifugación ,  disueltos   en  SDS y  ditiotreitol  y  sometidos  a SDS-PAGE. Se  cortaron  las  bandas  del gel  correspondientes  a PFK-1 y a PK y se  determinó  la  cantidad  de 32P  incorporado .

0.5
0.3
0.2
3.0 .O
2.4 e.
1.8
1.2
10
0.1 0.25 0.5 1
Glucagon, nM

FIGURA 4. Efecto del  glucagon  sobre la incorporación de 32P y la actividad de PK y PFK-1. En la figura 4 se muestra la actividad de PFK-1 (■ ) y de PK (●) y la incorporación de 32P a PFK-1 (□) y a PK (○). Las flechas indican las concentraciones de  glucagon  necesarias para 5 producir la mitad de la máxima inhibición enzimática y la mitad de la incorporación máxima de 32P a PFK-1 (↑) y a PK (↓).

Conclusión:  La adición de fosfatos a la enzima PFK-1 no es la causa de la disminución de la actividad enzimática.

Scene 3

Diagrama

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3.3. Los  autores   diseñaron   otro   experimento ,  en  el que PFK-1 se  precipitó  por el  agregado  de (NH4)2SO4. A  continuación , el  precipitado  se  resuspendió   en  buffer de  homogeneización  y se  dializó  contra el  mismo  buffer. Para  obtener  un  extracto   exento  de  actividad   enzimática , el  sobrenadante  (SN) de la  solución   tratada  con el (NH4)2SO4 se  incubó  con  suficiente   antisuero  contra PFK-1  como  para  precipitar   completamente  la  enzima . Se  midió  la  actividad  de PFK-1  en  la  reconstitución  del  extracto   precipitado   más  el  sobrenadante .

Scene 4

1.0
0.6
0.2
0.1
0.2 0.4 0.7 1
Fructose 6-phosphate, mM
FIGURA 5. Reconstituciån del efecto del glucagon sobre Ia actividad de PFK-I

Referencia
Extracto precipitado con (NH4)2S04 y dializado
Sobrenadante
*Tratado con glucagon 10 nM

Conclusión: El efecto del glucagón sobre la enzima ocurre debido a los efectos que tiene dicha hormona sobre el extracto libre de PFK-1 y no por efectos directos sobre la enzima propiamente dicha.

Scene 5

Mecanismo de modulación del glucagón sobre la enzima PFK-1

FIGURE 16-20 control o' the snthesis
and degradatbn of fructose 2S•bis•
A bloodßucose I—el as
of 'he enzyme
her«e to a ot Iruaose
High
of fructose 6•phosøhate "celerate
the 'orm•tion •tutt%e
the Of
bdunaional
Fructme
ADP
H20

Problema 3.

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