Problema 3.

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Problema 3 .

3. Claus y col. estudiaron la modulación de la fosfofructokinasa-1 (PFK-1; 6-fosfofructo-1-kinasa) (2). Los siguientes experimentos constituyen parte de dicho trabajo . 3.1. Hepatocitos aislados de ratas alimentadas ad libitum se incubaron en presencia (○) o ausencia (●) de glucagon 10 nM durante 10 minutos . Posteriormente , las células se homogeneizaron en buffer de fosfato de potasio 50 mM, pH 7.5 adicionando NaF 100 mM, EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol 20 mM y fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) 0,1 mM (buffer de homogenización ) y se determinó la actividad de PFK-1 en los extractos hepáticos . En la figura 3 se observa la actividad de PFK-1 en función de la concentración de fructosa 6-fosfato y el efecto del glucagon sobre la actividad de la enzima . Las flechas indican la K0,5.

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Conclusión: En presencia de glucagón se observa una disminución de la actividad de la PFK-1, dado por una disminución del K0,5 Hipótesis: El glucagón ejerce un efecto regulador sobre la enzima por fosforilación (directa o indirecta) que culmina en la disminución de la actividad de la misma.

Scene 2 (4m 43s)

3.2. En otro experimento , los hepatocitos aislados se resuspendieron en buffer Krebs Henseleit con bajo contenido en fosfato adicionado de 1 mCi de [32P]PO4 por gramo de hepatocito . La suspensión fue alicuotada e incubada durante 45 minutos para permitir la incorporación de 32P al ATP. A cada alícuota se le agregó glucagon para obtener concentraciones en el rango 0,1-10 nM y se incubó durante 10 minutos . Posteriormente , las células se homogeneizaron en buffer de homogeneización y se midieron las actividades de la PFK-1 y de piruvato kinasa (PK). Para determinar la incorporación de 32P a la PFK-1 y a la PK se utilizó la técnica de INMUNOPRECIPITACIÓN. Se obtuvieron dos fracciones solubles enriquecidas en PFK-1 y PK respectivamente . Después de una incubación de 16 horas a 4°C con los respectivos antisueros , los inmunoprecipitados fueron colectados por centrifugación , disueltos en SDS y ditiotreitol y sometidos a SDS-PAGE. Se cortaron las bandas del gel correspondientes a PFK-1 y a PK y se determinó la cantidad de 32P incorporado .

0.5 0.3 0.2 3.0 .O 2.4 e. 1.8 1.2 10 0.1 0.25 0.5 1 Glucagon, nM

FIGURA 4. Efecto del glucagon sobre la incorporación de 32P y la actividad de PK y PFK-1. En la figura 4 se muestra la actividad de PFK-1 (■ ) y de PK (●) y la incorporación de 32P a PFK-1 (□) y a PK (○). Las flechas indican las concentraciones de glucagon necesarias para 5 producir la mitad de la máxima inhibición enzimática y la mitad de la incorporación máxima de 32P a PFK-1 (↑) y a PK (↓).

Conclusión: La adición de fosfatos a la enzima PFK-1 no es la causa de la disminución de la actividad enzimática.

Scene 3 (7m 18s)

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3.3. Los autores diseñaron otro experimento , en el que PFK-1 se precipitó por el agregado de (NH4)2SO4. A continuación , el precipitado se resuspendió en buffer de homogeneización y se dializó contra el mismo buffer. Para obtener un extracto exento de actividad enzimática , el sobrenadante (SN) de la solución tratada con el (NH4)2SO4 se incubó con suficiente antisuero contra PFK-1 como para precipitar completamente la enzima . Se midió la actividad de PFK-1 en la reconstitución del extracto precipitado más el sobrenadante .

Scene 4 (7m 55s)

1.0 0.6 0.2 0.1 0.2 0.4 0.7 1 Fructose 6-phosphate, mM FIGURA 5. Reconstituciån del efecto del glucagon sobre Ia actividad de PFK-I

Referencia Extracto precipitado con (NH4)2S04 y dializado Sobrenadante *Tratado con glucagon 10 nM

Conclusión: El efecto del glucagón sobre la enzima ocurre debido a los efectos que tiene dicha hormona sobre el extracto libre de PFK-1 y no por efectos directos sobre la enzima propiamente dicha.

Scene 5 (9m 43s)

Mecanismo de modulación del glucagón sobre la enzima PFK-1

FIGURE 16-20 control o' the snthesis and degradatbn of fructose 2S•bis• A bloodßucose I—el as of 'he enzyme her«e to a ot Iruaose High of fructose 6•phosøhate "celerate the 'orm•tion •tutt%e the Of bdunaional Fructme ADP H20