Isolement et Purification de Deux Bactériocines 3D Produites par Enterococcus faecium avec Activité Inhibitrice Contre Listeria monocytogenes

Curr Microbiol (2011) 62:479–485 DOI 10.1007/s00284-010-9732-0 Isolement et Purification de Deux Bactériocines 3D Produites par Enterococcus faecium avec Activité Inhibitrice Contre Listeria monocytogenes Kaoutar Bayoub · Ilham Mardad · Emna Ammar · Aurelio Serrano · Abdelaziz Soukri Reçu : 9 octobre 2009 / Accepté : 13 juillet 2010 / Publié en ligne : 18 août 2010 © Springer Science+Business Media, LLC 2010 K. Bayoub, I. Mardad, A. Soukri — Laboratoire de Physiologie et Génétique Moléculaire (PGM), Faculté des Sciences, Département de Biologie, Ain Chock, Université Hassan II, Casablanca, Maroc. Email: [email protected] E. Ammar — Département de Génie Biologique/LARSEN, École Nationale d'Ingénieurs de Sfax, Sfax, Tunisie. A. Serrano — Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, CSIC-Universidad de Sevilla, Séville, Espagne. RÉSUMÉ La souche 3D, isolée d'un produit laitier traditionnel fermenté marocain et identifiée comme Enterococcus faecium, a été étudiée pour sa capacité à produire deux bactériocines agissant contre Listeria monocytogenes. Les bactériocines 3Da et 3Db se sont révélées thermostables et ont été inactivées par la protéinase K, la pepsine et la trypsine, mais pas lors d'un traitement à la catalase. Les bactériocines mises en évidence étaient stables sur une large gamme de pH allant de 2 à 11, et l'activité bactériocide a été maintenue pendant le stockage à 4 °C. Cependant, la combinaison de la température et du pH a influencé la stabilité des bactériocines. La purification par RP-HPLC des composés antimicrobiens montre deux fractions actives éluées à 16 et 30,5 min, respectivement. L'analyse par spectrométrie de masse a montré que E. faecium 3D produit deux bactériocines : l'Entérocine 3Da (3893,080 Da) et l'Entérocine 3Db (4203,350 Da). Cette souche est un organisme de qualité alimentaire et ses bactériocines sont des peptides thermostables aux pH basique, neutre et acide : de telles bactériocines peuvent présenter un intérêt majeur en tant que conservateurs alimentaires. Mots-clés : Bactériocines · Activité antimicrobienne · Enterococcus faecium · Listeria monocytogenes · Spectrométrie de masse · Conservateurs alimentaires INTRODUCTION Malgré l'utilisation de technologies modernes dans la production alimentaire et la mise en œuvre de normes de qualité, les intoxications alimentaires sont la cause de 6,5 à 33 millions de maladies humaines et de plus de 9 000 décès par an dans le monde [24]. La fermentation bactérienne des matières premières périssables est utilisée depuis des siècles pour préserver la valeur nutritive des aliments et des boissons sur une durée de conservation prolongée. Dans un certain nombre de fermentations alimentaires, l'événement clé est la conversion des sucres en acide lactique par les bactéries lactiques (BL, qui comprennent entre autres les genres Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus et Pediococcus). Ces bactéries figurent parmi les producteurs d'antagonistes microbiens les plus connus et les plus étudiés. Elles présentent un intérêt particulier en raison de la présence fréquente de bactériocines au sein de ce groupe et sont également largement utilisées dans l'industrie de transformation du lait, des aliments et de la viande. Leur rôle dans la conservation et les caractéristiques aromatiques des aliments est largement documenté [7, 22]. De nombreuses bactéries lactiques jouent un rôle important dans la production d'aliments fermentés. Elles bénéficient le plus souvent du statut généralement reconnu comme sûr (GRAS - Generally Recognized As Safe) et possèdent le potentiel de contrôler les pathogènes d'origine alimentaire ainsi que de prolonger la durée de conservation des aliments [2, 19, 30]. Les entérocoques font partie de la flore intestinale naturelle des humains et des animaux et jouent un rôle important dans le maintien de l'équilibre microbien [21] ; ils sont également prometteurs pour la bioconconservation des aliments, notamment par la production de bactériocines [13]. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomique, dont l'activité est généralement dirigée contre des espèces étroitement liées à la bactérie productrice [18, 20]. Les bactériocines, substances protéiques antibactériennes, sont des candidates appropriées pour une utilisation comme conservateurs naturels des aliments, capables d'inhiber la croissance de certaines bactéries d'origine alimentaire [8, 15]. De plus, comme la majorité des BL productrices de bactériocines sont des isolats alimentaires naturels, elles sont idéalement adaptées aux applications alimentaires. MATÉRIELS ET MÉTHODES Souches bactériennes et conditions de culture — Isolement bactérien Enterococcus faecium 3D a été obtenue à partir d'un produit laitier traditionnel fermenté (raîb ; du lait cru caillé traditionnel marocain obtenu par fermentation spontanée), dilué en série avec une solution saline stérile (NaCl 0,9% p/v). Des aliquotes de 0,1 ml ont été étalées sur des plaques d'gélose MRS (Man, Rogosa, Sharpe - Biokar, diagnostics, France). Les plaques ont ensuite été incubées à 30 °C pendant 24 h..

Traduction française intégrale — Article Scientifique (Curr Microbiol 2011) Page 1 / 4 Criblage de la production de bactériocines Listeria monocytogenes ATCC 19117 a été utilisée comme souche indicatrice dans les essais d'activité antimicrobienne. La souche indicatrice a été cultivée pendant 18 h à 37 °C et maintenue dans du TSB-YE (Tryptic Soy Broth - Extrait de levure - Biokar, France). En bref, les cultures ont été ensemencées par stries sur des plaques de gélose MRS et incubées pendant 24 h à 30 °C. Après incubation, les colonies ont été prélevées et piquées sur de nouvelles plaques de gélose MRS. Les nouvelles plaques ont été incubées à 30 °C pendant 16 h, puis 5 ml de gélose molle TS-YE (0,7%, p/v) contenant environ 106 UFC de L. monocytogenes ATCC 19117 ont été coulés sur les plaques. Après incubation à 30 °C pendant 24 h, les zones d'inhibition ont été examinées. Les colonies de bactéries lactiques présentant les zones d'inhibition les plus larges ont été sélectionnées et purifiées par isolement sur gélose MRS. La présence de composés antimicrobiens dans les surnageants de culture exempts de cellules a été confirmée en utilisant la méthode des gouttes sur gélose (agar spot method) [32]. Toutes les cultures ont été conservées de routine à 4 °C et maintenues sous forme de stocks congelés à -20 °C dans 40% de glycérol, repiquées et incubées deux fois pendant 18 à 24 h à 30 °C dans un milieu bouillon MRS avant utilisation expérimentale. Identification bactérienne La souche bactérienne a été identifiée par des analyses morphologiques, culturales et génétiques. Le gène de l'ADNr 16S a été séquencé. Pour l'identification génotypique, l'ADN total a été extrait des cultures bactériennes arrivées en phase stationnaire à l'aide du kit d'isolement d'ADN génomique Wizard (Promega) selon les instructions du fabricant, puis utilisé pour l'amplification par PCR. Les homologies ont été recherchées dans la base de données BLASTN (National Center for Biotechnology Information) en utilisant BLAST. Essai d'activité antibactérienne & Spectre d'inhibition Pour tester l'activité inhibitrice de la bactériocine et étudier ses propriétés physico-chimiques, la méthode de diffusion en puits sur gélose [31] a été employée. 10 ml de milieu gélose (0,7% p/v) ont été inoculés avec 0,1 ml d'une culture fraîche de nuit de la souche indicatrice et coulés dans une boîte de Petri. Des puits de 5 mm de diamètre ont été réalisés dans la gélose et remplis de 50 µl d'échantillon. Les plaques ont été incubées pendant 18 h à 30 °C puis examinées pour mesurer le diamètre des zones d'inhibition. Les surnageants de culture exempts de cellules (obtenus par centrifugation à 10 000 g à 4 °C pendant 10 min) ont été ajustés à pH 6 avec de la soude 1 M NaOH, puis filtrés sur membrane de 0,45 µm. Le spectre d'activité a été déterminé sur les souches listées dans le Tableau 1. Une zone d'inhibition claire d'au moins 2 mm de diamètre a été notée comme positive. Tableau 1 : Souches utilisées dans cette étude pour la détermination du spectre d'activité antimicrobienne, avec leurs milieux de culture et le diamètre de la zone d'inhibition. Souches indicatrices Milieux Zone d'inhibition (mm) Listeria monocytogenes ATCC 19117 TSB-YE 25 Enterococcus faecalis ATCC 29212 MRS 10 Lactobacillus bulgaricus 340 (Rhodia Food-France) MRS 14 Salmonella curvalis RVA 1876 (IP, Tunis) NB 8 Salmonella curvalis RV3 3935 (IP, Tunis) NB 9 Salmonella curvalis RVA 06 3607 (IP, Tunis) NB 9 Salmonella spp. 44846 (IP, Tunis) NB 8 Salmonella spp. 780 (IP, Tunis) NB 8 Salmonella spp. 3631 (IP, Tunis) NB 9 Salmonella spp. 2687 (IP, Tunis) NB 8 Salmonella typhimurium NRRL-B 4420 NB 9 Escherichia coli ATCC 25922 NB 2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 NB 3 Micrococcus luteus NCIMB 8166 NB 8 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 NB 5 Serratia marcescens (C.H.U) NB 0.

Traduction française intégrale — Article Scientifique (Curr Microbiol 2011) Page 2 / 4 Stabilité aux enzymes, à la chaleur et au pH Le surnageant de culture exempte de cellules a été traité avec de la catalase (SIGMA) et trois enzymes protéolytiques (Proteinase K, Pepsine, Trypsine) à une concentration finale de 1 mg/ml (incubation à 37 °C pendant 2 h). Pour le pH, les échantillons ont été ajustés de pH 2 à 11 avec NaOH 5M ou HCl 5N. Pour la stabilité thermique, les échantillons ont été chauffés à 121 °C pendant 15 min, 100 °C pendant 20 min, et 60 °C pendant 60 min. La combinaison pH/chaleur a été évaluée par autoclavage à 121 °C pendant 20 min aux différents pH. Mode d'action et protocole de purification L'unité d'activité arbitraire (AU/ml) a été définie. La bactériocine brute (640 AU/ml) a été ajoutée après 3 h de croissance de L. monocytogenes. La purification a impliqué une précipitation au sulfate d'ammonium (80%), une désalinisation sur membrane (1000 Da), une étape Sep-Pak C18 (élution par isopropanol/acétonitrile 2:1 dans TFA 0,1%), puis une RP-HPLC (colonne C18 VYDAC 5 µm). RÉSULTATS ET DISCUSSION Identification : La souche 3D (cocci Gram-positifs, catalase négative, oxydase négative, poussant à 10 et 45 °C, 6,5% NaCl, pH 9) présente 99% d'homologie de séquence d'ADNr 16S (454 pb) avec E. faecium. La production maximale (64 000 AU/ml) survient au début de la phase stationnaire. Tableau 2 : Effet des enzymes protéolytiques, du pH et de la température sur l'activité des bactériocines 3D. Traitement Activité Enzymes (1 mg/ml) Protéinase K / Pepsine / Trypsine - Catalase + pH (2 à 11) pH 2 – 11 + Température 60 °C (60 min) / 100 °C (20 min) / 121 °C (15 min) + (-) pas d'activité d'inhibition ; (+) activité d'inhibition conservée. Fig. 1 : Sensibilité des bactériocines de E. faecium 3D au pH combiné au traitement thermique (121 °C - 20 min). 0 10 18 2 4 5 6 7 9 10 11 pH seul pH + Traitement thermique (121°C) Fig. 2 : Effet des bactériocines de E. faecium 3D (6400 AU/ml) sur la croissance de L. monocytogenes. 0 0,6 1,2 (DO 600nm) Ajout bactériocines (3h) 0h 1h 2h 3h 4h 5h 7h.

Traduction française intégrale — Article Scientifique (Curr Microbiol 2011) Page 3 / 4 Tableau 3 : Étapes de purification des peptides anti-Listeria produits par E. faecium 3D. Étape de purification Volume (ml) Activité (AU/ml) Activité Totale (AU) Rendement (%) Extrait brut (surnageant de culture) 200 64 × 103 12 800 × 103 100 Précipitation au sulfate d'ammonium 10 1 024 × 103 10 240 × 103 80 Éluat C18 Sep-Pak 1 16 × 103 16 × 103 0,125 Éluat C18 RP-HPLC 0,5 8 × 103 4 × 103 0,03125 Purification des bactériocines et masse moléculaire Un protocole en trois étapes a été développé (Tableau 3). L'étape Sep-Pak C18 a confirmé le caractère hydrophobe des peptides. L'étape finale de RP-HPLC a permis de résoudre deux pics d'activité distincts élués respectivement à 16 min (Entérocine 3Da) et 30,5 min (Entérocine 3Db). L'analyse par Tricine-SDS-PAGE a révélé deux bandes actives situées entre 4 et 7 kDa. La spectrométrie de masse MALDI-TOF a fourni les masses moléculaires exactes de 3893,080 Da (3Da) et 4203,350 Da (3Db). Ces masses sont proches de l'entérocine Q (3970,31 Da) et de l'entérocine CRL35 (4308,55 Da). CONCLUSION De cette étude, il peut être conclu que les peptides antimicrobiens sont thermostables et insensibles aux conditions acides et alcalines (pH 2-10), mais sensibles aux enzymes protéolytiques. Leur activité inhibitrice est supprimée après traitement à la protéinase K, la trypsine et la pepsine. Leur large spectre antimicrobien, couplé à leur haute résistance thermique et au pH, fait des bactériocines 3D d'excellentes candidates comme conservateurs naturels pour aliments fermentés. Remerciements : Les auteurs expriment leur gratitude à M. El Mzibri, Unité de recherches biologiques et médicales - CNESTEN (Rabat, Maroc), pour l'identification moléculaire des souches. RÉFÉRENCES 1. Batdorj B, et al. 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