Réplication de l'ADN

[Audio] RÉPLICATION DE L'ADN 36 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] I. CARACTERISTIQUES GENERALES A. LA RÉPLICATION A LIEU PENDANT LA PHASE S DU CYCLE CELLULAIRE La réplication correspond au doublement de la masse d'ADN avant la mitose. Cette duplication de l'information génétique n'a lieu qu'une seule fois au cours du cycle cellulaire. Elle se déroule au cours de la phase S, de synthèse, elle perpétue l'information génétique et permet le maintien de son intégrité, en particulier les gènes codant les protéines mais aussi les gènes codant pour les ARN régulateurs. 37 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] B. EXPÉRIENCE DE MESELSON ET STAHL En 1958, deux scientifiques, Meselson et Stahl, ont mis au point une expérience afin d'étudier le processus de conservation de l'ADN au cours de la réplication. Pour cela, ils ont cultivé des bactéries dans un milieu contenant uniquement de l'azote lourd 15N (a). Après extraction de cet ADN et centrifugation en gradient de chlorure de césium (permet de séparer les molécules d'ADN en fonction en leur constituants), ils observent une seule bande homogène qui migre au niveau du 15N. Ces bactéries sont ensuite cultivées dans un milieu contenant uniquement de l'azote 14N (b), après un cycle de réplication, une centrifugation en gradient de chlorure de césium est réalisée et les scientifiques observent une bande hybride homogène qui migre entre 14N et 15N. Après un nouveau cycle de réplication dans le milieu contenant uniquement 14N (c), l'expérience est réitérée et les scientifiques observent alors 2 bandes, une au niveau de 14N et une bande hydride entre 14N et 15N. Pour les cycles de réplication suivants (d), ayant toujours lieu dans un milieu constitué uniquement de 14N, les scientifiques observent toujours les 2 mêmes bandes mais la bande au niveau de 14N s'intensifie alors que l'intensité de la bande hybride diminue. Cette expérience a ainsi pu démontrer le processus semi-conservatif de la réplication de l'ADN. En effet, les 2 brins constitués de 15N sont utilisés pour la réplication et donnent 2 molécules filles hybrides constituées chacune d'un brin 15N et d'un 14N. Au cycle suivant, chacune de ces molécules vont donner 2 molécules filles, l'une sera hydride et l'autre sera uniquement constituée de 14N et ainsi de suite. 38 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] C. LA RÉPLICATION EST UN PROCESSUS SEMI-CONSERVATIF Chaque molécule fille d'ADN conserve un brin parental qui a engendré son brin complémentaire. Les 2 molécules filles sont donc chimiquement identiques. Les brin d'ADN sont orientés (5'-3'), complémentaires et antiparallèles. Du fait de l'appariement des nucléotides (A/T et G/C), chaque brin d'ADN sert de matrice pour la synthèse du brin complémentaire. Cette faculté de perpétuer l'information génétique peut être confrontée à 2 problèmes, l'absence de fidélité de la réplication ou l'altération secondaire de la structure de l'ADN par des agents chimiques ou physiques. II. INITIATION DE LA RÉPLICATION Chez les eucaryotes, les séquences définissant les origines de réplication sont très nombreuses (plusieurs centaines de milliers) mais ne sont pas connues avec précision (on sait seulement qu'elles sont riches en adénine et en thymine). La décondensation de la chromatine est nécessaire à la réplication afin de permettre l'accès aux protéines d'ouverture de la double hélice et de synthèse de la molécule d'ADN. Cette décondensation se fait par exemple par l'acétylation des histones H3 et H4 qui diminue l'affinité des nucléosomes pour l'ADN. Toutes les régions du génome ne sont pas répliquées simultanément, certaines sont synthétisées précocement et d'autres tardivement. L'initiation de la réplication est donc séquentielle. 39 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] Les topoisomérases réalisent la détorsion de la chaîne d'ADN. L'initiation de la traduction a lieu en phase G1, avant le début de la phase S, avec la reconnaissance des origines de réplication et la fixation du complexe ORC (avec CDT1 et CDC6) et MCM ayant une activité hélicase participant à la détorsion de l'ADN qui vont former le complexe de pré-réplication, inactif jusqu'à la phase S. A. ORIGINE DE RÉPLICATION La réplication commence avec l'activation d'une origine de réplication, l'ADN va s'ouvrir, et la synthèse d'ADN va s'étendre de part et d'autre de l'origine de réplication. On dit que la réplication est bidirectionnelle. Lorsque les fourches de réplications (les extrémités) se rencontrent, elles définissent une frontière délimitant les différents réplicons, c'est-à-dire l'endroit où l'ADN va se répliquer. On voit sur la Figure 1 que la réplication de R2 est plus précoce que celle de R3 ou R1, il y a une activation séquentielle des origines de réplication. Figure 1 40 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] B. DÉTORSION DE L'ADN L'ouverture du brin d'ADN nécessite l'action des topoisomérases qui vont couper le brin d'ADN, permettant aux 2 brins de se détordre et de s'ouvrir, puis il y aura une ligation aussi effectuée par la topoisomérase. C. FORMATION DU COMPLEXE DE PRÉINITIATION Le complexe de pré-initiation se met en place pendant la phase G1, la protéine est séquestrée par la géminine. La digestion de la géminine entraîne la libération de CDT1 qui s'associe avec CDC6 sur ORC (Origin Recognition Complex). L'association de ces 3 protéine attire le complexe MCM (MiniChromosome Maintenance proteins) à activité hélicase. Le complexe de réplication est centré sur l'origine de réplication et comprend de part et d'autre des complexes MCM. 41 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] D. FIN DU PROCESSUS D'INITIATION Au moment de l'entrée en phase S, il y a activation du complexe de pré initiation par la dégradation de CDT1 et l'élimination de CDC6 puis ouverture de la chaîne double brin par l'activité hélicase du complexe MCM. Ce complexe va effectivement permettre la rupture des liaisons hydrogènes entre les bases appariées. Les brins séparés sont stabilisés (en position ouverte) par les protéines RP-A (Replication Protein A) et/ou SSB (Single Strand Binding proteins), pour éviter que les liaisons hydrogène se reforment entre les bases. La fixation de la polymérase α (Pol α ou primase) peut alors se faire et l'amorce ARN-ADN est alors synthétisée. Pol α est une ARN polymérase-ADN dépendante qui présente aussi des activités primase et ADN polymérase. 1. Fonctionnement de l'hélicase L'hélicase est un hexamère (6 sous-unités agrégées les unes aux autres). Elle progresse de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' du brin qu'elle entoure, de manière à ouvrir la double hélice d'ADN. La progression de l'hélicase sur l'ADN simple brin se fait par hydrolyse l'ATP en ADP et entraîne la création de 2 brins d'ADN monocaténaire. 42 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] 2. Fonctionnement de la primase (Pol-𝛼) L'ARN polymérase ADN dépendante (Pol α) va synthétiser une petite amorce ARN à partir d'un brin d'ADN matrice par intégration de ribonucléotides triphosphates (rNTP) et ne nécessite pas d'amorce. Cette polymérisation se fait dans le sens 5'-3'. On suppose que la primase α synthétise une amorce ARN car les dimères ARN/ ADN sont plus stables que les dimères ADN/ADN ce qui permet d'assurer le démarrage de la polymérisation. III. ÉLONGATION OU POLYMÉRISATION La décompaction des surenroulements négatifs (= super tours) par les topoisomérases I et II permet le déroulement de l'ADN situé autour des nucléosomes, qui sont alors relargués dans le milieu. Après mise en place de la fourche de réplication (qui se créée avec l'ouverture de la double hélice et qui avance avec l'hélicase), la reconnaissance du complexe matrice-amorce se fait par remplacement de Pol α par les ADN polymérases δ ou ε, dites processives car elles avancent rapidement. Ces 2 ADN polymérases participent à la polymérisation des brins complémentaires à partir de l'amorce ARN mais n'ont pas tout à fait le même rôle. En effet, L'ADN polymérase δ polymérise le brin retardé, en sens inverse de la propagation de la fourche, après fixation grâce à la protéine PCNA puis va former plusieurs fragments appelés fragments d'Okazaki. Concernant l'ADN polymérase ε, elle est responsable de la polymérisation du brin direct, dans le même sens que la propagation de la fourche. 43 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] A. FOURCHE ET COMPLEXE DE RÉPLICATION La fourche de réplication est disposée de manière asymétrique puisqu'il y aura un brin direct (en haut), synthétisé de 5'-3' et dont la matrice est orientée 3'-5'. La synthèse du nouveau brin d'ADN se fait alors dans le même sens que l'avancée de la fourche de réplication. À l'opposé, sur le brin retardé (en bas), la matrice est orientée 5'-3' donc la synthèse se fait à l'opposé de l'avancée de la fourche de réplication, elle est donc discontinue. En effet la réplication du brin retardé se fait par la synthèse de fragments d'Okasaki, qui sont de petits ADN néosynthétisés. Avec la progression de la réplication, le nombre de fragments d'Okazaki augmente ; le fragment le plus ancien est le plus éloigné de la fourche de réplication et le plus récent est celui le plus proche. B. SYNTHÈSE SEMI-DISCONTINUE Le brin continu, direct, précoce ou conducteur est synthétisé dans le même sens que la propagation de la fourche de 5' vers 3' car le brin parental est orienté 3'-5'. 44 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] Le brin discontinu, indirect, tardif ou retardé est synthétisé en sens inverse de l'avancée de la fourche de réplication via la synthèse de petits fragments appelés fragments d'Okazaki. Ces fragments ont une longueur de 100 à 200 bases. C. CARACTÉRISTIQUE DE L'ÉLONGATION La formation et l'allongement du brin néosynthétisé se fait par fixation des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) les uns après les autres. L'ordre d'intégration des dNTP est défini par le brin matrice ou parental, par complémentarité des bases (A+T et C+G). Les brins matrices et néosynthétisés sont antiparallèles. En effet, le brin matrice est « lu » dans le sens 3'-5' alors que le nouveau brin est toujours synthétisé dans le sens 5'-3'. La polymérisation est donc unidirectionnelle, elle est catalysée par une ADN polymérase ADN-dépendante. 1. Complémentarité des bases Les nucléotides A (adénine) et T (thymine) s'apparient via la formation de 2 liaisons hydrogènes et les nucléotides G (guanine) et C (cytosine) s'apparient grâce à 3 liaisons hydrogènes. Dans les 2 cas, il y a appariement d'une purine (A et G) avec une pyrimidine (C et T) 45 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] 2. Intégration d'un nucléotide au brin néosynthétisé Le groupement phosphate (5') le plus proche du nucléotide attaque chimiquement le groupement hydroxyle (3') du nucléotide précédemment intégré. Cette réaction, catalysée par l'ADN polymérase, permet la liaison entre les groupements phosphate et hydroxyle des 2 nucléotides et donc à la fixation en 3' du nucléotide. Les bases d'un même brin ne sont pas liées entre elles, contrairement au squelette osidique, mais elles interagissent avec leur base complémentaire. Cette réaction fondamentale de la synthèse de la chaine polynucléotidique d'ADN est responsable de l'orientation 5'-3' et explique que la polymérisation est unidirectionnelle. Un pyrophosphate (= 2 groupements phosphates) est libéré pendant cette réaction. 3. Ligation des fragments d'Okazaki L'ADN polymérase α à activité primase synthétise les amorces ARN et permet à l'ADN polymérase δ synthétiser les fragments d'Okazaki. Il y a donc autant d'amorce ARN que de fragment d'Okazaki. Après synthèse de ces fragments il faudra les lier entre eux afin d'obtenir un brin homogène. Cette activité est réalisée par une ADN ligase. En effet, lorsque l'ADN polymérase δ arrive au niveau de matrice ARN suivante, celle-ci est détruite, les brèches sont ensuite comblées par l'ADN polymérase δ et l'ADN ligase va ensuite lier les fragments d'Okazaki entre eux. 46 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] D. DIFFÉRENTS TYPES D'ADN POLYMÉRASES L'activité exonucléase correspond à la capacité de digérer par l'extérieur des nucléotides précédents, qui permet de digérer les amorces ARN. BER et NER sont différents systèmes de réparation de l'ADN. IV. PARTICULARITÉS DE LA RÉPLICATION DE L'ADN CHEZ LES EUCARYOTES A. TÉLOMÈRES ET TÉLOMÈRASES 1. Télomères Les télomères sont les fragments terminaux des chromosomes qui présentent une extrémité 3' plus longue qui se replie sur elle-même. Ces fragments sont constitués de séquences répétitives en tandem non codantes riches en TTAGGG. Elles permettent le repliement des télomères qui servent à maintenir l'intégrité du matériel génétique. 47 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] En effet, elles permettent de limiter le raccourcissement des chromosomes au fur et à mesure des divisions cellulaires en protégeant l'ADN des exonucléases (DNAse). La préservation de l'intégrité des télomères est cruciale. À chaque cycle, 50 à 200 nucléotides sont perdus, cela contribue au raccourcissement des télomères, et des chromosomes. En effet, aux extrémités 3' des chromosomes, la réplication nécessite la synthèse d'une amorce ARN qui sera dégradée mais qui ne sera pas remplacée (au niveau du premier fragment d'Okasaki). Par conséquent, la réplication de ces extrémités est incomplète. Ainsi, la longueur des télomères reflète le nombre de mitoses, elle est considérée comme l'horloge du vieillissement cellulaire, au fur et à mesure des divisions cellulaires, les télomères raccourcissent. Quand les télomères sont trop courts, la cellule rentre en quiescence. 2. Activité télomérase Sans activité télomérase, il y a donc érosion des télomères, qui aboutit à la mort cellulaire si les télomères sont complètement digérés. Or, dans certaines situations physiologiques, lors de l'embryogenèse notamment, des multiplications cellulaires massives sont nécessaires et les télomères ne doivent pas raccourcir. Cette activité va diminuer progressivement après la naissance jusqu'à disparaître à l'exception de certaines cellules : les cellules souches adultes (ex : les cellules souches hématopoïétiques) et germinales. L'activité télomérase est aussi retrouvée dans certaines pathologies, notamment au niveau des cellules cancéreuses qui surexpriment les télomérases, leur conférant ainsi leur immortalité. 3. Caractéristiques de la télomérase La télomérase est une transcriptase inverse, c'est-à-dire quelle synthétise de l'ADN à partir d'ARN (ADN polymérase ARN dépendante) La télomérase est une ribonucléoprotéine constituée de 2 sous- unités : - Une sous-unité catalytique, codée par le gène hTERT, présentant l'activité enzymatique recherchée. - Une matrice ARN (hTR) présentant la séquence complémentaire AATCCC 48 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] La télomérase compense donc le raccourcissement télomérique lié aux mitoses en ajoutant des séquences TTAGGG aux extrémités des chromosomes à partir de sa matrice ARN. L'allongement de l'extrémité 3' des télomères se fait donc en recopiant l'amorce ARN guide interne. Cela permet d'allonger l'extrémité d'ADN matrice et d'agrandir les télomères (aussi à l'extrémité 5') B. QUANTITÉ D'ADN AU COURS DU CYCLE CELLULAIRE Les 46 chromosomes à 1 (ou 2) chromatide sont répartis en 22 paires d'autosomes et 1 paire de gonosomes aussi appelés chromosomes sexuels. Pendant la phase G1 les chromosomes ont 1 chromatide. Ensuite il y a la phase de synthèse ou on double la quantité d'ADN ce qui fait que les chromosomes ont 2 chromatides en phase G2. Lors de la mitose, les chromosomes migrent aux pôles apicaux de la cellule afin d'obtenir 2 cellules avec 46 chromosomes à une chromatide. Ce n'est pas une division réductionnelle, à l'inverse de la méiose, car on ne perd pas de chromosome, seul le nombre de chromatide change. 49 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] C. RÉPARTITION DES NUCLÉOSOMES AU COURS DE LA RÉPLICATION Les nucléosomes sont néosynthétisés afin de rejoindre la double hélice en cours de synthèse. Le CAF (Chromatine Assembly Factor) synthétise les histones pour former de nouveaux nucléosomes sur le brin en cours de réplication. Quel que soit le brin en cours de synthèse, il y a un panachage de chromosomes ancien et nouveau, il n'y a pas tous les nucléosomes nouveaux sur le brin direct. V. RÉPLICATION DE L'ADN MITOCHONDRIAL A. MITOCHONDRIES Les mitochondries possèdent leur propre génome. Ce sont des organites autoréplicatifs. Leur génome contient 16569 pb soit environ 200 000 fois moins que le génome nucléaire. Il est circulaire et contient 2 brins complémentaires : H (lourd) et L (léger). Dans chaque mitochondrie, il y a plusieurs centaines de génomes et il y a plusieurs milliers de mitochondries par cellule. B. RÉPLICATION DU GÉNOME MITOCHONDRIAL La réplication de l'ADN mitochondrial suit à peu près les mêmes étapes que la réplication du génome nucléaire : - Relâchement de l'ADN par des topoisomérases - 2 origines de réplication bien définies : oriH et oriL - pas de fourche de réplication - réplication unidirectionnelle de chaque brin - les deux brins sont répliqués l'un après l'autre dans des directions opposées 50 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.

[Audio] VI. CONCLUSION La réplication permet le maintien et la constance du génome humain, ce qui fait que nous sommes des organismes composés de dizaines milliards de cellules qui ont toutes le même génome. La régulation de la réplication permet une réplication très fidèle de l'ADN en un temps extrêmement court. La fidélité de la réplication assure la constance du génome humain à chaque division mitotique. Une dérégulation de la réplication va aboutir à une accumulation progressive de mutations pouvant être à l'origine de prolifération cellulaire non contrôlée et donc de cancer. L'inhibition de la réplication et/ou des topoisomérases sont des cibles thérapeutiques pour certaines pathologies, notamment les processus de prolifération anormaux ou les cancers. Par exemple, des agents intercalants ou alkylants, vont ajouter des groupements spécifiques sur les bases de l'ADN. 51 Cours Galien Bordeaux – 2024/2025 PASS UE 7 – Biochimie et biologie moléculaire de la cellule – Polycopié 1/2.