Aprendiendo entre todos

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Aprendiendo entre todos

Química Biológica Superior Módulo 2: control de la glucolisis/gluconeogenesis Problemas 6 y 7

Scene 2 (10s)

Comisión 3 Grupo 5 04/2021

Integrantes: Rosario Laffont Luisa Ramallo Nahuel Ríos

Scene 3 (19s)

Problema 6

Tanaka y col. estudiaron la modulación de la actividad de PK (5). Purificaron la PK tipo L a partir de hígado de ratas alimentadas con una dieta rica en carbohidratos, y la PK tipo M a partir [Fru 2,6-P2] (µM) [Fru 2,6-P2] (µM) 9 de músculo de rata. La actividad se determinó por el método de la lactato deshidrogenasa (LDH). Incubaron la PK en la siguiente mezcla de reacción: buffer Tris 50 mM, pH 7,4, MgSO4 5 mM, KCl 100 mM, NADH 0,2 mM, ADP 0,2 mM, 2 UI de LDH y las concentraciones de fosfoenolpiruvato (PEP) indicadas en la figura 8. La actividad se expresa como la disminución de la absorbancia por minuto a 340 nm

Scene 4 (58s)

6.1 ¿Cuál es la reacción metabólica que cataliza PK y la reacción acoplada a NADH que la pone en evidencia?

Scene 6 (1m 14s)

6.2 efecto del agregado de la fructosa 1,6-bisfosfato sobre la actividad de PK hepática y muscular

Scene 7 (1m 25s)

6.3 efecto del ATP sobre la actividad de la PK

Scene 8 (1m 34s)

6,4.¿Cuál es el efecto del agregado de la fructosa 1,6-bisfosfato sobre la acción del ATP?

Scene 9 (1m 45s)

Problema 7

Piruvato kinasa (PK) es un excelente modelo para estudiar el rol de la dinámica de una proteína en la modulación de la cooperatividad. Esta enzima puede ser aislada a partir de varios tejidos. La modulación de la actividad enzimática por efectores alostéricos, como la alanina, el ATP y la fructosa 1,6-bifosfato, puede ser evaluada a través de la medición del piruvato, producto de la reacción.

Scene 10 (2m 9s)

7.1. La figura 10 muestra la actividad enzimática relativa determinada en las mismas condiciones, de PK aislada a partir de músculo esquelético (MPK) o de riñón (KPK). La producción de ácido pirúvico fue determinada en presencia de ATP, F1,6-bisP o alanina. La actividad basal - en ausencia de efectores alostéricos - fue tomada como 100%. Cada barra representa el promedio de la actividad ± SD de órganos provenientes de 5 animales.

FIGURA 10. Actividad enzimática relativa de la PK aislada a partir de riñón de conejo (blanco) o músculo esquelético de conejo (gris) en ausencia o presencia de ATP 1 mM, F1,6bisP 0.01 mM o Ala 0.5 mM.

7.1.1. ¿Cuál es el resultado obtenido?

Scene 11 (2m 47s)

7.1.2. Plantee una hipótesis que explique el resultado.

HIPÓTESIS: La MPK y la KPK poseen diferencias estructurales en su sitio de regulación. Dicha diferencia es fundamental para la interacción del sitio con los moduladores antes mencionados, es por ello que la actividad relativa de la KPK se ve modificada por estos compuestos y la de la MPK no. También puede deberse a que la MPK no es sujeto de regulación por fosforilación (en el caso del ATP). Se puede pensar entonces que ambas son dos isoformas de la PK.

Scene 12 (3m 16s)

7.2. Varios grupos de investigación estudiaron la estructura de esta enzima aislada de distintos organismos y tejidos (6). Muirhead y col. (7) obtuvieron la estructura cristalográfica de la PK aislada de músculo esquelético (MPK) y determinaron que es un homo-tetrámero. Cada subunidad consta de 530 aminoácidos organizados en 3 dominios (A, B y C). El sitio activo se encuentra entre los dominios A y B de cada subunidad, alejado de los sitios efectores que se encuentran distribuidos en distintas zonas de la subunidad. El mecanismo de modulación de PK implica comunicación a través de sitios distantes. En el tetrámero, los monómeros se comunican a través de dos interfases formadas por los dominios A y C de subunidades adyacentes. Mediante el alineamiento de la secuencia de la enzima aislada a partir de riñón y músculo esquelético, se determinó que existen 22 aminoácidos diferentes en el dominio C, mientras que los dominios A y B poseen una identidad cercana al 100%.

Scene 13 (4m 2s)

7.2.1. A partir de estos nuevos resultados ¿Cuál sería la ubicación en el tetrámero de los 22 aminoácidos en que difieren la PK modulada y la no modulada?

Scene 14 (4m 15s)

7.2.2. ¿Qué hipótesis plantearía para explicar los resultados de la figura anterior teniendo en cuenta los nuevos datos descriptos?

Scene 15 (4m 27s)

7.2.3. ¿Qué estrategia plantearía para demostrar la respuesta anterior?

Se podría modificar la PK muscular de manera tal que presente una estructura similar a la PK renal, y luego enfrentándolas ante los moduladores, evaluar la respuesta de las isoenzimas. Ambas enzimas deberían responder de manera semejante. Por otro lado también podrían realizar una mutación del dominio C y observar la cinética enzimática. De esta forma, podrían mutarse diferentes residuos, cuya mutación pudiera tener más o menos efecto sobre la modulación de la actividad enzimática, y observar el efecto de esa mutación como motivo de estudio .

Scene 16 (4m 58s)

7.3. Para dilucidar el rol de los 22 residuos en las diferentes propiedades de la MPK, Friesen y col. (8) mutaron el residuo S402 por P402 de acuerdo con la diferencia entre las dos isoformas. La estructura cristalográfica del tetrámero no mostró diferencias significativas respecto del wild type. La figura 11 muestra la actividad enzimática de la PK muscular, renal y la mutante S402P expresada como velocidad inicial de reacción en función de la concentración de sustrato.

FIGURA 11. Velocidad inicial en función de la concentración de sustrato de la reacción catalizada por MPK (Piruvato kinasa aislada de músculo esquelético de conejo); S402P (Piruvato kinasa mutante de la piruvato kinasa de músculo esquelético de conejo); KPK (Piruvato kinasa aislada de riñón de conejo)

Scene 17 (5m 34s)

7.3.1. Analice la figura 11 y justifique las curvas obtenidas. ¿Podría inferir a qué PK corresponde cada curva si no lo explicitara la figura? Justifique.

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Scene 18 (5m 48s)

7.3.2. ¿Cómo describiría el comportamiento de la mutante S402P?

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Scene 19 (5m 58s)

7.3.3. Carminatti y col. (9) describieron que los moduladores alostéricos F1,6bisP, Ala y ATP sólo aumentan o disminuyen la afinidad aparente por el sustrato. ¿Cuál espera que sea la conducta y ubicación relativa de estas curvas para cada isoforma wild type en presencia de dichos moduladores?

Como se mencionó anteriormente, la curva sigmoidea es la compatible con un modelo de enzima modulada, por lo tanto esa curva va a ser la que represente a la KPK en presencia de estos moduladores. La Ala y el ATP disminuyen la actividad de la misma ya que son moduladores alostéricos heterotrópicos negativos, por lo tanto moverán la curva hacia la derecha, aumentando la K0,5 (ya que disminuyen la afinidad aparente) mientras que la F16BP la aumenta (debido a que es modulador positivo), moviendo la curva hacia la izquierda (y tiene un comportamiento más hiperbólico)y disminuyendo la K0,5. En el caso de la enzima MPK, no se observaría ningún efecto sobre la curva en presencia de estos moduladores, ya que ésta no está modulada por éstos.

Scene 20 (6m 49s)

7.3.4. ¿Cuál es su conclusión a partir de estos resultados?

Comparando las diferentes isoformas de la enzima, se comprobó que en la modulación parece ser crítica una región de 22 aminoácidos que se encuentra en el dominio C (en la interfaz entre monómeros), lo que se observa en que la mutación S402P de PK muscular que otorga modulación a esta variante. La curva de actividad de la PK muscular en función de la concentración de PEP es hiperbólica, esto significa que no presenta modulación por parte del sustrato, y con concentraciones de PEP relativamente bajas se llegaría a la velocidad máxima de la enzima, en cambio la curva de la KPK tiene una forma sigmoidea característica de una enzima modulada. Por lo tanto, concluimos que para la isoforma renal, el PEP tiene un efecto homotrópico positivo; el ATP y la L-alanina tienen efectos heterotrópicos negativos y la Fructosa 1,6 BiP tiene efecto heterotrópico positivo. La isoforma muscular no está modulada por estas moléculas.