G2 2021 TP 1

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Scene 1 (0s)

Guía de trabajo práctico N° 1 ADN recombinante, Marcadores moleculares y Diversidad Genética

Scene 2 (6s)

De izquierda a derecha, se observa: Un individuo heterocigota, con un alelo F y uno S. Otro de igual genotipo a 1. Un individuo homocigota SS. Un individuo homocigota FF. Otro igual genotípicamente a 4. Otro igual genotípicamente a 4 y a 5. En base a lo detallado anteriormente, responda: a) A qué se hace referencia cuando se dice que las alozimas son un “marcador codominante”? b) Reflexione sobre cuáles son las posibles causas por las cuales las alozimas tienen menor nivel de polimorfismo que los marcadores de ADN. Explique brevemente.

EJEMPLO DE UN GEL DE ELECTROFORESIS DE ALOENZIMAS: En este gel, se visualizan diferentes variantes de una misma enzima que cataliza una reacción en hepatocitos (aloenzima F y aloenzima S). Tanto la variante F como la S cumplen la misma función.

Aloenzimas

Scene 3 (33s)

Enzimas de Restricción

Endonucleasas de restricción: reconocen sitios específicos en la doble hélice de ADN generando cortes en ambas hebras. Los sitios entre 4 a 8 pbs, la mayoría de tipo II reconocen 4 o 6 cortando dentro del sitio de reconocimiento. Cortes romos o pegajosos. Secuencias palindrómicas.

Scene 4 (43s)

Ejercicio con enzimas de restricción

Se ha cortado con PstI un plásmido circular que contiene resistencia a la ampicilina. Tras la electroforesis se observa una banda de 20 Kb. ¿Qué deducirías de los resultados que se plantean a continuación?

a) Con EcoRI, el plásmido se corta en dos fragmentos: uno de 11.5 Kb y otro de 8.5 Kb b) La digestión PstI+EcoRI genera tres fragmentos de: 6 Kb, 5.5 Kb y 8.5 Kb c) El ADN del plásmido cortado con PstI se ha mezclado y ligado con fragmentos de ADN cortados con PstI. Todos los clones recombinantes son resistentes a la ampicilina. d) Tras cortar uno de los clones recombinantes con PstI se obtienen dos fragmentos: 20 Kb y 6 Kb. e) El clon anterior se corta con EcoRI y se obtienen 10 Kb, 8.5 Kb y 7.5 Kb.

Scene 5 (1m 4s)

Esquema de hibridación molecular

Scene 6 (1m 10s)

En la figura se muestra una secuencia de ADN correspondiente a la hebra 5´--3´. En los bloques verdes observamos la secuencia específica de cada uno de los cebadores que se utilizarán en la reacción de PCR para amplificar una región con microsatélites indicada en letras rojas. Utilizando el esquema inferior como ayuda: a) Determinar la condición de primer directo y primer inverso. b) ¿Cuál es la secuencia de bases respectiva de cada primer? y ¿ cuál su orientación? c) Estimar el tamaño esperado en pares de bases (pbs) del producto de amplificación

Ejercicio de Diseño de Primers para la amplificación de ADN a través de PCR

Scene 7 (1m 26s)

Esquema de Amplificación de ADN a través de PCR

Ver video Adjunto

Scene 8 (1m 33s)

Esquema básico para Clonar un fragmento de interés

Ver video Adjunto

Scene 9 (1m 40s)

En base a las figuras 7 y 8 de la guía, y a los videos sugeridos en los siguientes links; conteste las siguientes preguntas (Clonación del ADN: https://www.youtube.com/watch?v=arQU-bbxcUM PCR: https://www.youtube.com/watch?v=mslMRgxbdOA) ¿Cuáles son las principales diferencias entre ambas técnicas? ¿Cuál es la principal ventaja de la PCR? En cuanto a las técnicas en sí: En la clonación, ¿Cómo cortan las enzimas de restricción? ¿Y en qué pasos de la clonación actúan? ¿Cómo se pueden detectar las células bacterianas que hayan incorporado el plásmido que porta el ADN de interés? En la PCR, ¿por qué la Taq Polimerasa es capaz de sintetizar ADN a alta temperatura (a 72º C)? ¿Ocurre esto normalmente con las polimerasas animales?

Actividad de resolución de preguntas surgidas a partir de la interpretación de los videos correspondientes a clonación y PCR

Scene 10 (2m 6s)

a) ¿Qué diferencia existe entre los diferentes alelos de un mismo locus de microsatélite? b) ¿Cuántos alelos tienen los diferentes loci de microsatélites analizados en este estudio? c) ¿Se puede saber el número de repeticiones para cada uno de ellos?¿Y el motivo de repetición? d) Si el individuo 1 es la madre del individuo 2, ¿cuáles de los otros tres individuos pueden descartarse como posibles padres?

En un análisis con 4 marcadores de microsatélites se obtuvieron los siguientes resultados para 5 individuos (los números indican tamaños de fragmentos amplificados en pb)

Individuo 1

Individuo 2

Individuo 3

Individuo 4

Individuo 5

Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1

Locus 1 130 134 134 134 136 138 128 134 128

Locus 2 250 256 256 260 258 260 252 260 250

Locus 3 140 140 140 144 146 148 138 144 140

Locus 4 187 193 185 187 183 189 185 191 181

Ejercicio de microsatélites

Scene 11 (2m 26s)

microsatélites - ejercicio

1-¿Qué significan los segmentos lineales rojos y las flechas contiguas a la región VNTR? 2-¿Qué técnica permite discriminar o diferenciar los fragmentos amplificados que poseen distinto tamaño? ¿A qué se deben las diferencias en los tamaños de dichos fragmentos de ADN? 3-En el esquema del gel, ¿cuántas muestras de ADN de diferentes individuos se han incluido en el análisis? 4-¿cuántos alelos hay en este conjunto de 5 individuos? ¿Cuál es el de mayor tamaño? ¿Y el de menor? 5-¿Cuál es el número máximo de alelos que puede tener un individuo diploide? Describir qué individuos son homocigotas o heterocigotas y qué alelos poseen.

Scene 12 (2m 44s)

En la figura se muestra una imagen obtenida a partir de un Gel de secuenciación con marcaje radioactivo con P32 en el extremo 5 ´ de acuerdo al Principio de Sanger. Determinar la secuencia de ADN que se resuelve a partir de este método.

Secuenciación con radiactivo

Espacio de respuestas

Scene 13 (2m 55s)

Esquema de la Técnica de Secuenciación automática del ADN

Scene 14 (3m 1s)

En la figura se muestra el perfil obtenido a partir de la secuenciación automática. En cada reacción se utilizó un colorante fluorescente verde para la A, uno negro para la G, uno rojo para la T y uno azul para la C. ¿Cual seria la secuencia de las 86 bases observadas en el perfil de esta reacción?

Lectura a partir de Secuenciación automática del ADN

Espacio de respuestas

Scene 15 (3m 13s)

ADN recombinante: genoma mitocondrial

Discutir las bases de dos de las principales características de la molécula del ADN mitocondrial:   Herencia materna Genes completamente ligados

Scene 16 (3m 24s)

Ejercicio de SNP polimorfismos de un solo nucleótido

1. ¿Cuál es, o cuáles son, los SNPs 100% correlacionados con el color del pelaje?

2. ¿Cuál es, o cuáles son, los SNPs parcialmente correlacionados con el color del pelaje?

3. ¿Cuáles son los SNPs no correlacionados con el color del pelaje?

4. ¿Cuáles son dos explicaciones posibles de por qué un SNP puede estar correlacionado con un fenotipo como el color del pelaje?

Resultado de la identificación de SNPs en una muestra de perros con diferente fenotipo de color de pelaje (blanco y negro).

Scene 17 (3m 39s)

Uso de microsatélites para filiación familiar.

En esta familia, se han empleado marcadores de microsatélites para identificar los hijos de la pareja “madre-padre”. Estos análisis se realizan empleando un número de loci de microsatélites no menor a 16, para elaborar un perfil genético de los progenitores y de sus posibles descendientes. En este caso, les presentamos un gel donde se ha revelado uno solo de estos loci de microsatelites, pero que sin embargo ha sido suficiente para descartar a 3 personas como posibles hijos. ¿Cuáles son las personas descartadas como posibles hijos?

Scene 18 (3m 54s)

Ejercicio de Análisis molecular de enfermedad de Huntington

A B C D

La enfermedad de Huntington es una enfermedad neurodegenerativa que aparece en uno de cada 10.000 individuos a edad avanzada. Los primeros síntomas de la enfermedad son problemas motrices. No se ha podido relacionar con ninguna proteína o polipéptido conocido. Sin embargo, existe un marcador polimórfico asociado al defecto. Todos los individuos que padecen la enfermedad presentan dos sitios de restricción Hind III extra en el cromosoma 4, convirtiendo un fragmento de 20 kpb en dos fragmentos de 17,5 y 2,5 kpb y un segundo fragmento de 4,9 kpb en dos fragmentos de 3,7 y 1,2 kpb, respectivamente.

Sitios Hind III y los haplotipos asociados con la enfermedad. El marcador genético utilizado como sonda aparece como un rectángulo oscuro sobre el ADN de la región. Los sitios Hind III extra de los pacientes llevan un (H*).

a) ¿Qué fragmentos pueden observarse en una electroforesis de las muestras de cada uno de los individuos digeridas con Hind III?   b) ¿Cómo espera que resulte la autorradiografia cuando se haga la hibridación con la sonda?