R épublique Algérienne Démocratique et Populare part 1

Exposé République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement et de la Recherche Scientifique Université M’Hamed Bougara Boumerdès Faculté de sciences Département de : Biologie Domaine : Science de la Nature et de la Vie Filière : Ecologie et Environnement Spécialité : Ecologie Microbienne Thème : ❖ Réalisé par : ➢ AMI LYNA ➢ MOULOUDJ MELISSA ➢ BEN BOUGARRA YASMINE Année Universitaire 2024/2025 Diversité Microbienne dans le cycle d’Azote.

1 Introduction Étapes du Cycle Biologique de l'Azote Processus de Nitrification et Nitratation Assimilation de l'Azote Dénitrification Applications des Micro-organismes dans l'Agriculture et l'Industrie Anammox Conclusion Impact Anthropique sur le Cycle de l'Azote Ammonification Évolution du Cycle de l'Azote PLAN DE.

2 Table des matières 1. Introduction o 1.1 Le Cycle de l'Azote................... ▪ 1.1.1 Cycle biologique ▪ 1.1.2 Cycle planétaire ▪ 1.1.3 Imbrication des cycles biologiques o 1.2 Objectifs de l’étude.................. 2. Étapes du Cycle Biologique de l'Azote o 2.1 Fixation.................................... o 2.2 Symbiose Microbienne dans le Cycle de l'Azote .................... ▪ 2.2.1 Fixation biologique du diazote ▪ 2.2.2 Les bactéries fixatrices d'azote ▪ 2.2.3 Le cas des rhizobiums chez les légumineuses ▪ 2.2.4 Le cas des cyanobactéries ▪ 2.2.5 Dialogue fabacées-rhizobiacés ▪ 2.2.6 La voie de signalisation NOD o 2.3 Évolution des Symbioses Fixatrices d'Azote........................... ▪ 2.3.1 Origine et apparition ▪ 2.3.2 Spécificité ▪ 2.3.3 Autres plantes à la rhizosphère fixatrice d'azote ▪ 2.3.4 Plantes disposant de microorganismes « endophytes » o 2.4 Mesure de la Fixation Biologique du Diazote......................... 3. Processus de Nitrification et Nitratation o 3.1 Nitritation et nitratation................................................... o 3.2 Nitrification................................................................ ▪ 3.2.1 Chimie ▪ 3.2.2 Découverte ▪ 3.2.3 Inhibition ▪ 3.2.4 Nitratation alternative par l'ozone.

3 4. Assimilation de l'Azote o 4.1 Réduction des nitrates........................................... o 4.2 Assimilation de l'ammoniac................................... o 4.3 Assimilation de l'azote moléculaire (N2)........................ o 4.4 Assimilation de l'azote minéral....................................... o 4.5 Assimilation des nitrates et des nitrites.............................. o 4.6 Assimilation des ions ammonium (NH4+)................................. o 4.7 Assimilation de l'azote organique (urée)................................... o 4.8 Formation et destruction des protéines.................................... o 4.9 Catabolisme des acides aminés.................................................... 5. Dénitrification o 5.1 Importance écologique........................................................ o 5.2 Mécanismes biologiques...................................................... o 5.3 Enjeux environnementaux....................................................... o 5.4 Recherche et développement.................................................... 6. Anammox (Oxydation Anaérobie de l'Ammonium) o 6.1 Observation in vivo.................................................................. o 6.2 Spécificités des bactéries anammox................................................... o 6.3 Température de l'eau.................................................................. o 6.4 Application au traitement des eaux usées................................ o 6.5 Intérêt écologique................................................................ 7. Impact Anthropique sur le Cycle de l'Azote o 7.1 Histoire des apports anthropiques en azote...................................... o 7.2 Impacts des apports anthropiques dans le cycle de l'azote................. ▪ 7.2.1 Atmosphère ▪ 7.2.2 Biosphère ▪ 7.2.3 Écosystèmes aquatiques ▪ 7.2.4 Acidification des eaux douces ▪ 7.2.5 Eutrophisation des systèmes marins 8. Évolution du Cycle de l'Azote o 8.1 Azote géologique........................................................ o 8.2 En mer....................................................................

4 o 8.3 Dans un aquarium............................................................ 9. Ammonification o 9.1 Ammonification chez les animaux................................................. o 9.2 Prise en charge de l'ammoniac par les microorganismes........................... o 9.3 Minéralisation......................................................................... o 9.4 Assimilation ou minéralisation.................................... o 9.5 Devenir de l'ammoniac......................................... o 9.6 Application en traitement des eaux usées..................................... 10. Applications des Micro-organismes dans l'Agriculture et l'Industrie • 10.1 Applications en agriculture.................................... • 10.2 Applications en industrie................................. 11. Conclusion.................................. 12. Remerciements.....................................................

5 1/-INTRODUCTION 1.1 Le Cycle d’Azote Le cycle de l'azote est un cycle biogéochimique qui décrit la succession des modifications subies par les différentes formes de l'azote neutre en formes réactives (diazote, nitrate, nitrite, ammoniac, azote organique) et vice-versa. Les analyses isotopiques de l'azote faites dans différents compartiments géologiques et de la biosphère et notamment dans les sédiments lacustres montrent que ce cycle a été récemment fortement perturbé par l'Homme qui a plus que doublé la quantité d'azote réactif (Nr) annuellement ajoutés à la biosphère1, essentiellement à partir de 1895 ± 10 ans (± 1 pour l'écart-type) avec une forte augmentation dans les années 1960 à 2010, principalement dans l'hémisphère Nord2. L'azote est un composé de base de la matière organique, en particulier pour la synthèse des acides aminés constituant les protéines et les bases nucléiques de l'ADN. De ce fait, la réduction de N2 est considérée comme aussi essentielle à l'évolution et à la perpétuation de la vie sur Terre que la photosynthèse3. D'autre part, les composés de l'azote participent au métabolisme cellulaire, comme matériau à oxyder en milieu oxygéné, ou au contraire comme oxydant accepteur d'électrons en milieu anoxique. 1.1.1 Cycle biologique Dans le cycle biologique, l'azote se présente sous forme d'ion ammonium, de nitrate ou de nitrite, ou de matière organique. • Les végétaux assimilent l'azote, soit directement sous forme d'ion ammonium, soit sous forme de nitrate ou de nitrite qu'ils réduisent par photosynthèse ; et le transforment en matière organique..

6 • Les champignons, animaux et monocellulaires hétérotrophes ne peuvent assimiler l'azote que sous forme de matière organique, qu'ils utilisent également comme source d'énergie. • La décomposition de matières organiques restitue de l'ammoniaque. • L'oxydation de cette ammoniaque par certaines bactéries leur fournit de l'énergie, et produit des nitrites, puis des nitrates. Cependant, dans notre environnement globalement oxydant, l'ion ammonium est normalement oxydé et ne s'accumule pas de manière significative. En dehors de la biomasse, où son nombre d'oxydation est -3, l'azote du cycle biologique se présente généralement sous forme oxydée, N(+iii) ou N(+v) 1.1.2 Cycle planétaire Ce cycle biologique s'insère dans un cycle plus global : • Quelques bactéries et cyanobactéries peuvent fixer l'azote atmosphérique sous forme de NH3 incorporé, et sont le point d'entrée du cycle biologique ; • En milieu anaérobie, d'autres bactéries réalisent la dénitrification du milieu en les réduisant successivement en monoxyde d'azote, puis en protoxyde d'azote, et enfin en diazote, qui est restitué à l'atmosphère et sort du cycle biologique. Le cycle naturel de l'azote a toutefois été fortement perturbé par les activités humaines, qui ont modifié la disponibilité de l'azote, avec des implications encore mal évaluées pour les écosystèmes à travers le monde. De nos jours, près de 30% de l'azote fixé est produit industriellement par le procédé Haber4. 1.1.3 Imbrication des cycles biologiques À travers la fixation biologique de l'azote réalisée par certaines cyanobactéries, l’inhibition de la nitrogénase par l'O2, que ce soit directement ou indirectement via des radicaux oxydants, constitue un régulateur fort de la teneur en oxygène dans l'atmosphère, dans le cycle de l'oxygène, par la rétroaction négative qu'il a sur la fixation de l'azote5. Une inhibition dans la fixation de l'azote conduirait à une chute de la productivité primaire, à la fois directement pour les cyanobactéries diazotrophes et indirectement pour l'ensemble de la productivité primaire de l'hydrosphère, induisant à plus long terme, pour le cycle du carbone, une réduction dans le rythme d'enfouissement du carbone organique. Sans enfouissement il n'y a pas de création nette d'O2 par la biosphère, et l'oxygène en excès espèce très réactive, disparaît progressivement par l'oxydation de la surface de la planète. 1.2 Objectifs de l’etude : L'étude de la diversité microbienne dans le cycle de l'azote vise à comprendre comment les micro- organismes influencent les transformations de l'azote, essentielles pour la fertilité des sols et la productivité végétale. Les microbes, notamment les bactéries nitrifiantes et dénitrifiantes, jouent un rôle clé dans la minéralisation, la nitrification, et la dénitrification123. Cette recherche met en lumière les interactions complexes entre les communautés microbiennes et les processus biogéochimiques, contribuant à une meilleure gestion des écosystèmes et à la préservation de la biodiversité.

7 2/-Étapes du cycle biologique 2.1 Fixation L'atmosphère contient une grande quantité de diazote (79 % en volume), mais cet azote gazeux est très peu biodisponible pour la plupart des espèces. Seules quelques bactéries et cyanobactéries (principalement présentes dans le sol), telles qu'Azotobacter vinelandii, peuvent fixer l'azote atmosphérique, sous forme de NH3 incorporé, qu'elles transforment ensuite en matière organique. Certaines de ces bactéries produisant de l'ammoniaque, comme Rhizobium, vivent en symbiose avec des plantes. Les actinorhizes sont des nodosités fixatrices d'azote qu'on trouve au niveau des racines des plantes (ici, racine d'aulne). Les bactéries fixatrices de l'azote produisent de l'ammoniaque (NH4OH) à partir de l'azote atmosphérique et de l'hydrogène de l'eau (l'ammoniaque est le nom de la forme soluble dans l'eau du gaz ammoniac). La fixation de l'azote nécessite un flux important d'ATP3. Le processus de fixation d'une molécule d'azote en deux molécules d'ammoniac est couplé à l'hydrolyse de 16 ATP en milieu acide, et cogénère une molécule d'hydrogène. La réaction de fixation est globalement la suivante6 : N2 + 16 ATP + 8 e− + 8 H+ → 2 NH3 + H2↑ + 16 ADP + 16 Pi Elles le font grâce à une enzyme, la nitrogénase qui est capable de casser la triple liaison N≡N qui rend l'azote gazeux si stable, mais uniquement dans certains contextes, car cette réaction de transformation d'azote atmosphérique en NH3 assimilable par les organismes a des coûts énergétique et métabolique élevés, et fait appel à d'autres éléments nécessaires à la biosynthèse de la nitrogénase. Pour ces raisons, l'azote biodisponible est un puissant facteur limitant pour la production de biomasse algale et végétale, et donc pour la productivité de nombreux écosystèmes. Ceci explique aussi que la disponibilité en azote joue un rôle majeur dans la structuration et les dynamiques d'évolution de nombreuses communautés végétales. La décomposition d'organismes morts (nécromasse) par des bactéries saprophytes sous forme d'ions ammonium (NH4+) est une autre source d'ammoniaque. 2.2 Symbiose Microbienne dans le Cycle de l'Azote La symbiose microbienne joue un rôle crucial dans le cycle de l'azote, notamment à travers les interactions entre les légumineuses et les bactéries fixatrices d'azote, telles que les rhizobiums. Ce processus commence lorsque les racines des légumineuses libèrent des composés chimiques, appelés flavonoïdes, qui attirent les bactéries rhizobiales présentes dans le sol. En réponse, les rhizobiums produisent des facteurs Nod, des signaux moléculaires qui induisent la formation de nodules sur les racines des plantes hôtes. Ces nodules servent de micro-environnements protecteurs où les bactéries convertissent le diazote atmosphérique (N₂), une forme d'azote non assimilable par les plantes, en ammoniac (NH₃), une forme utilisable pour la croissance végétale..

8 À l'intérieur des nodules, le processus de fixation de l'azote est catalysé par l'enzyme nitrogénase, qui nécessite une grande quantité d'énergie sous forme d'ATP pour casser la triple liaison du diazote. Cette transformation est essentielle pour enrichir le sol en azote biodisponible, améliorant ainsi la fertilité des sols sans avoir recours aux engrais chimiques. En échange de ce service, la plante fournit aux rhizobiums des composés carbonés issus de la photosynthèse, ainsi que d'autres nutriments, assurant ainsi leur survie et leur prolifération. Cette symbiose présente plusieurs avantages écologiques et agronomiques. Elle non seulement favorise la croissance des légumineuses en augmentant leur apport en azote, mais elle réduit également la dépendance aux engrais azotés synthétiques, dont la production est énergivore et contribue aux émissions de gaz à effet de serre. De plus, les légumineuses, grâce à cette association symbiotique, jouent un rôle clé dans la rotation des cultures en régénérant naturellement la teneur en azote des sols. Ce mécanisme symbiotique constitue un exemple emblématique de mutualisme, où les deux partenaires bénéficient mutuellement, tout en contribuant à la durabilité des écosystèmes agricoles. 2.2.1 Fixation biologique du diazote (Article détaillé : Fixation biologique du diazote.) La fixation biologique de l'azote, ou diazotrophie (du grec di, « deux », azo, « azote », et trophos, « alimentation »), est le processus du cycle de l'azote qui permet à un organisme de produire (indirectement) des substances protéiques à partir de l'azote gazeux (N2) présent dans l'atmosphère et l'environnement. L'acronyme BNF est parfois utilisé par les anglophones pour résumer l'expression « biological N2-fixation ». Le rôle du microbiote du sol est considérable et très varié : humification et minéralisation, mycorhization, fixation de l'azote atmosphérique, défense des plantes par champignons endophytes….

9 Vue au microscope électronique à transmission d'une section transversale d'un nodule racinaire bactérien endophyte dans une racine de soja. La bactérie Bradyrhizobium japonicum a colonisé l'intérieur des racines du soja et y a établi une symbiose fixatrice d'azote. Cette image (en fort grossissement) montre le réticulum endoplasmique, le dictyosome et la paroi cellulaire. Elle peut être symbiotique lorsqu'elle est liée à la formation de nodosités, ou a symbiotique lorsqu'elle implique des bactéries diazotrophes qui restent libres dans le sol ou en association plus ou moins étroite avec les plantes, comme colonisateurs épi- ou endophytique1. La fixation par les bactéries symbiotiques, plus efficace, constitue le processus naturel dominant de fixation de l'azote dans la majorité des écosystèmes terrestres, permettant aux espèces pionnières de coloniser des milieux pauvres en azote. La fixation a symbiotique de l'azote qui joue un rôle important dans les milieux gorgés d'eau et les déserts, est estimée de 23 % à 32 % du total d'azote assimilé par les plantes2. Cette stratégie d'acquisition de nutriment met en jeu le processus de réduction enzymatique de N2 (azote moléculaire) en azote ammoniacal, ou ammoniac (NH3) : cette forme de N combiné, appelée intermédiaire-clé, représente la fin de la réaction de fixation et le début de l'incorporation de l'azote fixé dans le squelette carboné. Dans le système biologique fixateur de N2 les conditions optimales de la catalyse biologique correspondent à une pression de 0,2 à 1,0 atm de N2 et une température de 30- 35 °C, alors que les conditions de la catalyse industrielle sont très sévères : pression de 250-1000 atm de N2 et température de 450 °C3 Ce processus est comparable à celui de la photosynthèse qui permet de produire des substances glucidiques à partir du dioxyde de carbone (CO2) de l'atmosphère. Mais, alors que la photosynthèse est le fait de tous les végétaux (sauf les végétaux saprophytes), la fixation de l'azote ambiant n'est réalisée que par certaines espèces de bactéries comme les cyanophycées. Toutefois, de nombreuses plantes, principalement de la famille des Fabaceae (légumineuses), la réalisent de façon indirecte, en symbiose avec des bactéries de leur rhizosphère, qui se localisent généralement dans des nodosités situées sur leurs racines. Jusqu'à une date récente, on pensait que les champignons mycorhiziens pouvaient fixer N2. On sait maintenant que cette propriété est limitée aux bactéries4,5 et n’a jamais été montrée chez les champignons filamenteux. La fixation de N2 par une racine mycorhizée est due non au champignon mais aux bactéries associées de sa mycorhizosphère. Cette activité, qui peut être mesurée in situ par la cinétique de réduction de l’acétylène en éthylène, est d'ailleurs encore plus importante dans la litière forestière que dans la mycorhizosphère elle-même6..

10 Ces bactéries produisent une enzyme, la nitrogénase, qui permet de réaliser la synthèse de l'ammoniac par une réaction de réduction fortement exergonique et endothermique (en raison de la très forte énergie de la liaison triple de N2, 940,5 kJ/mol, elle exige 16 ATP pour la fourniture de l'énergie d'activation)7,8 : N2 + 16 ATP + 8 e− + 8 H+ → 2 NH3 + H2↑ + 16 ADP + 16 Pi dans les conditions du sol, à l'opposé des 450 °C des procédés industriels qui requièrent aussi une pression moyenne de l'ordre de 400 atmosphères. L'ammoniac est ensuite transformé en acides aminés utilisables par les plantes. La nitrogénase est en réalité un complexe enzymatique formé de sous-unités, dont le fonctionnement est in vitro inhibée par l'oxygène. Mais dans le processus de symbiose son fonctionnement est rendu possible en zone de microaérobiose (dans les nodules racinaires) voire en condition aérobie à l'intérieur des racines de plantes non légumineuses (avec l'aide de microorganismes dites « endophytes » selon Santi & al en 20139 qui semble ainsi bénéficier de condition10,11. Par ailleurs les micro-organismes diazotrophes (fixatrices d'azote) ont de leur côté développé plusieurs stratégies de protection de leur complexe nitrogénase12,13. L’inhibition de la nitrogénase par l'O2, que ce soit directement ou indirectement via des radicaux oxydants, constitue un régulateur fort de la teneur en oxygène dans l'atmosphère, dans le cycle de l'oxygène, par la rétroaction négative qu'il a sur la fixation de l'azote14. Une inhibition dans la fixation de l'azote conduirait à une chute de la productivité primaire, à la fois directement pour les cyanobactéries diazotrophes et indirectement pour l'ensemble de la productivité primaire de l'hydrosphère, induisant à plus long terme, pour le cycle du carbone, une réduction dans le rythme d'enfouissement du carbone organique. Sans enfouissement il n'y a pas de création nette d'O2 par la biosphère, et l'oxygène en excès espèce très réactive, disparaît progressivement par l'oxydation de la surface de la planète. 2.2.2 Les bactéries fixatrices d'azote Il existe des bactéries libres qui vivent dans le sol et assurent la fixation de l'azote, soit seules, soit en symbiose avec d'autres bactéries. Ce sont souvent des bactéries auxiliaires de la mycorhization (en), d'où leur forte densité au niveau de la rhizosphère où elles peuvent recevoir les apports carbonés des exsudats racinaires. Elles sont caractérisées par la fixation a symbiotique de l'azote (l'association avec les racines n'est pas étroite alors que la symbiose au sens strict implique une interaction très intime). D'autres fixent l'azote atmosphérique, en relation plus ou moins étroite avec les plantes, comme colonisateur épi- ou endophytique15. Elles présentent une grande diversité de modes de productions d'énergie : métabolisme respiratoire aérobie (Azotobacter, Bacillus, cyanobactéries du genre Nostoc, Anabaena, Calothrix), associée à différentes stratégies pour éviter que leur nitrogénase soit en contact avec l'oxygène (augmentation de l'activité respiratoire pour réduire le taux d'oxygène environnant, développement d'hétérocystes) ; métabolisme anaérobie obligatoire (Clostridium, Chlorobium, Chromatium) ou facultative (Aerobacter, Klebsiella, Pseudomonas) ; métabolisme microaérophile (Azospirillum)16,17. D'autres espèces bactériennes développent une association symbiotique hautement spécialisée avec le système racinaire des plantes, faisant intervenir la création d'un nouvel organe, la nodosité : • groupe des Rhizobia (Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium (en)…) : légumineuses (fabacées) et ulmacées ; • Frankia : diverses espèces d'angiospermes, essentiellement arbres et arbustes (au sein des Casuarinacées, Eleagnacées, Myricacées, Rosacées, etc.), notamment les aulnes, l'argousier, les Casuarinaceae et le Myrica gale. Dans les océans, ce sont les Cyanobacteria qui fixent le diazote. Il en existe deux types:.

11 • Les cyanobactéries dites « filamenteuses », telles que Trichodesmium sp., qui vivent en colonie ; • Les cyanobactéries unicellulaires, appelées UCYN, qui peuvent vivre libre ou en symbiose avec certaines espèces du phytoplancton. 2.2.3 Le cas des rhizobiums chez les légumineuses Les différentes espèces de bactéries rhizobiums, qui sont capables d'infecter les racines des légumineuses (famille des Fabacées), sont plus ou moins spécifiques de certaines plantes-hôtes. Ainsi Rhizobium phaseoli infecte les haricots (Phaseolus sp). Les bactéries provoquent la formation de nodosités sur les racines en pénétrant par les poils racinaires, et se transforment en « bacteroides » de plus grande taille. Les nodosités sont le siège d'une activité symbiotique dans laquelle la plante fournit les sucres et l'énergie issus de la photosynthèse, et bénéficie en retour des acides aminés qui y sont produits. Cette activité peut produire annuellement jusqu'à 300 kg d'azote à l'hectare, qui se retrouvent en partie dans les récoltes exportées (protéines des graines et fourrages) et en partie enfoui dans le sol, utilisable par les cultures suivantes (engrais vert). Au niveau mondial, on estime à 100 millions de tonnes par an la masse d'azote ainsi fixé, soit le même ordre de grandeur que la production d'azote de l'industrie chimique. 2.2.4 Le cas des cyanobactéries Les cyanobactéries ont établi au cours de l'évolution des végétaux, des symbioses avec un large spectre de plantes hôtes : bryophytes, ptéridophytes, lichens, gymnospermes (cycas), angiospermes (Gunnera)18. 2.2.5 Dialogue fabacées-rhizobiacés La formation des nodules racinaires met en jeu un dialogue moléculaire complexe entre la plante-hôte et les rhizobiacées. La plante sécrète des signaux de type flavonoïdes, bétaïnes. La perception de ces signaux par la bactérie induit l’expression de nombreux gènes bactériens, dont une centaine sont connus. Les plus étudiés sont les gènes nod (ou bien nol et noe). Les gènes Nod D expriment des protéines régulatrices en réponse aux inducteurs végétaux. Une fois activées les protéines Nod D se fixent sur des séquences nod-box, promoteur des gènes nod de structure et activent leur transcription. Ces gènes produisent des facteurs Nod essentiels dans l’établissement de la symbiose. Les facteurs NOD activent une voie de signalisation faisant intervenir une série de gènes de la plante-hôte, et provoquent finalement des modifications morphologiques et cytologiques de la racine, pour aboutir à la formation des nodules. 2.2.6 La voie de signalisation NOD De nombreux gènes ont été identifiés chez le pois (Pisum sativum), le lotier (Lotus japonica) et la luzerne faux-tribule (Medicago truncatula). Ce sont tous des récepteurs SYMRK (symbiosis receptor like kinase), possédant un domaine kinase côté intracellulaire (RLK, Receptor like kinase) et des motifs riches en LysmM (interaction avec les facteurs NOD) côté extracellulaire. Les gènes sont appelés Nfr (Nod factor receptor) ou Sym (symbiosis genes). Il pourrait y avoir deux types de récepteurs, un contrôlant l’infection de la racine par la bactérie, l’autre permettant la courbure des poils absorbants..

12 Quelques dizaines de secondes après l’application des facteurs Nod, on observe un influx rapide de calcium qui induit une dépolarisation de la membrane plasmique entrainant la courbure et la déformation de poils absorbants. Dix minutes après des oscillations périodiques et transitoires de la concentration de calcium cytosolique se produisent à proximité de la région périnucléaire. Ces oscillations calciques (calcium spiking) sont dues à deux protéines membranaires DMI1 et DMI2. Ce dernier est un récepteur de type RKL (receptor like kinase) présentant trois domaines riches en Leucine (LRR). La réponse à ces oscillations est due au gène DMI3 codant une protéine kinase calmoduline et calcium dépendante. Cette protéine perçoit les variations de concentration en calcium à la fois par liaison à des calmodulines liées au calcium et au calcium libre. DMI3 est activé par l’autophosphorylation de son domaine kinase. De plus, DMI3 exerce un retrocontrôle négatif sur DMI1 et DMI2, et donc sur les oscillations calciques. DMI3 active l’expression des gènes ENOD (early noduline genes, gènes à nodulines précoces), protéines produites par la plante pendant les premières étapes de la symbiose, (comme la leghemoglobine) impliquées dans l’infection et l’organogenèse des nodules activant la division des cellules corticales. Cependant les substrats intermédiaires de DMI3 ne sont pas encore bien déterminés. 2.3 Évolution des symbioses fixatrices d’azote 2.3.1 Origine et apparition Il semblerait que les rhizobiacées ont recruté la voie de signalisation des mycorhizes et que l'organogénèse du nodule soit dérivée du programme génétique de l'organogénèse des racines secondaires. Les endosymbioses fixatrices d'azote seraient apparues il y 65 millions d'années. L’ancêtre commun à toutes ces espèces aurait développé une endosymbiose bactérienne, grâce à une certaine prédisposition à l’organogénèse nodulaire (la formation de nodules étant un détournement du programme génétique de formation des racines secondaires). Il est probable que la capacité à former des nodosités soit apparue plusieurs fois et indépendamment au cours de l'évolution. Cette aptitude a aussi été perdue plusieurs fois, par exemple pour l’adaptation à des sols plus fertiles. Cela permet d'expliquer la présence de plantes sans nodules à l'intérieur du clade des plantes à nodules. 2.3.2 Spécificité Deux « forces de sélection » antagonistes pourraient rendre compte de la spécificité des symbioses fixatrices d'azote. 1. La première de ces forces, positive, est l'augmentation du taux d'azote fixé par la plante hôte colonisée par le micro-organisme fixateur d'azote. 2. La seconde, négative, est l'invasion de la plante hôte par un pathogène non productif. Une spécificité faible semble se rencontrer dans les genres de plantes primitives, alors que la spécificité des symbiotes augmente au cours de l'évolution. Au niveau moléculaire on peut définir trois niveaux de spécificité lors du dialogue plante hôte rhizobium. Les gènes Nod sont portés par un plasmide bactérien. Des transferts horizontaux de gènes peuvent alors s'effectuer, ce qui transfère également les spectres d'hôtes. Ceci explique l'interaction entre des espèces de bactéries éloignées évolutivement et des plantes hôtes proches, et inversement. Ainsi il y a une coévolution entre les gènes de la symbiose et les plantes hôtes, et non entre les rhizobiacées et les plantes hôtes..

13 2.3.3 Autres plantes à la rhizosphère fixatrice d'azote De nombreuses plantes ont des associations similaires : • Allocasuarina ainsi que d'autres genres de la famille des Casuarinaceae • Alnus ou Aulne (famille des Betulaceae) • Azolla (famille des Azollaceae) • Casuarina (famille des Casuarinaceae) • Ceanothus (famille des Rhamnaceae) • Cercocarpus (famille des Rosaceae) • Cycadacée (famille des Cycadaceae) • Elaeagnus umbellata (famille des Elaeagnaceae) • Gunnera (famille des Gunneraceae) • Lobaria - Lobaria cuneifolia (L.) Haw.; nom retenu: Saxifraga cuneifolia subsp. cuneifolia20, Désespoir-du-peintre, Saxifrage à feuilles en coin (famille des Saxifragaceae) avec certains lichens. • Myrica (famille des Myricaceae) • Purshia tridentata (angl. antelope bitterbrush) (famille des Rosaceae) • Robinia pseudoacacia, Leucaena leucocephala (famille des Fabaceae) • Shepherdia argentea (angl. silver buffaloberry) (famille des Elaeagnaceae) Une vieille variété de maïs, cultivée dans des régions montagneuses de la Sierra Mixe dans le sud du Mexique, possède des racine aériennes dont les exsudats mucilagineux favorisent le développement de bactéries diazotrophes qui permettent à la plante de tirer de 29 à 82 % de son azote de l'air ambiant grâce à cette association symbiotique (taux d’azote fixé que seules les Légumineuses peuvent atteindre)19. 2.3.4 Plantes disposant de microorganismes « endophytes » Depuis les années 2000 à 2015, plusieurs espèces végétales présentant des endophytes fixateurs d'azote ont été trouvées, dont : • Azoarcus sp (herbacée) 21 ; • Canne à sucre22 ; • riz sauvage23,24 ; • maïs25,.

14 • Sorghum halepense26 ; • Miscanthus27,28 ; • cactus Mammillaria fraileana29 ; • Patate douce30,31 ; • mousses des forêts boréales32 ; • herbacées dunaires (Ammophila arenaria et Elymus mollis33 ; • plants de café Coffea arabica L.34 ; • plants de conifères (Pinus flexilis et Picea engelmannii ) inoculé avec Paenibacillus polymyxa35,36. La capacité de fixation de l'azote a été directement quantifiés chez quelques graminées (canne à sucre, blé et riz37,21,38,39). 2.4 Mesure de la fixation biologique du diazote Elle se fait par deux moyens : • un premier test utilise le fait qu'il existe un isotope stable de l'azote : l'isotope 15N2 qui est chimiquement inerte et naturellement rare dans l'atmosphère (bien plus rare que l'autre isotope de l'azote : 14N). La mesure du taux d'incorporation de cet isotope dans les tissus vivants d'une plante est la méthode la plus directe de dosage de la fixation biologique du diazote (N2). Si une plante ou un tissu végétal contient plus cet isotope qu'un autre, c'est qu'il a bénéficié d'un moyen de capter des quantités plus importantes de diazote de l'air et de le transformer en azote moléculaire biodisponible (pour produire des acides aminés ou des protéines). Même une faible augmentations de l'isotope 15N par rapport à une plante-témoins indique une fixation de N240. Il est possible pour les besoins d'expériences de laboratoire d'acheter des bombonnes d'azote 15N2 comprimé (98 % des atomes sont des isotopes 15N2)41 ; • un autre moyen (dit « ARA » par les anglophones ; acronyme de « Acetylene reduction assay ») est un « test de réduction de l'acétylène » ; c'est une évaluation cette fois indirecte de la fixation de l'azote atmosphérique N242. Certaines études, par précaution, utilisent à la fois ces deux tests, comme l'étude de 2016 qui a pour la première fois montré l'existence de bactéries diazotrophes symbiotes d'espèces pionnières dans les branches d'arbre (saules ou peupliers pionniers s'épanouissant sur des milieux fortement carencés en azote)41..

15 3/- Processus de Nitrification et nitratation 3.1 Nitritation et nitratation Dans la nature, la décomposition de matières organiques restitue de l'ammoniac, qui donne par exemple une odeur d'égout aux eaux trop stagnantes. Dans les sols bien oxygénés, mais aussi en milieu aquatique oxygéné, des bactéries transforment l'ammoniac (NH3) en nitrites (NO2−), puis en nitrates (NO3−), au cours du processus de nitrification. L'oxydation de cet ammoniac par ces bactéries leur fournit l'énergie nécessaire pour transformer le CO2 en matière organique (autotrophie)7. La nitrification se déroule en deux étapes8, réalisées par deux populations bactériennes différentes. Une première étape de nitritation oxyde l'amoniac en nitrite, consommant une molécule d'oxygène par molécule formée : NH3 + O2 → NO2− + 3H+ + 2e− Nitrification d'urine en bioréacteur. Le déchet toxique des nitrites de la première communauté bactérienne est ensuite utilisé comme métabolite par la seconde. Ce phénomène de symbiose est appelé syntrophie9. Cette seconde étape de nitratation transforme ensuite le nitrite en nitrate: NO2− + H2O → NO3− + 2H+ + 2e− La nitrification est une source d'acidité pour le sol. C'est cette consommation en milieu oxygéné qui est à l'origine de la présence de nitrates assimilables par les végétaux. En aquariophilie, la nitrification est indispensable pour que l'aquarium ne s'empoisonne pas sous l'effet de l'accumulation de l'ammoniaque. Pour favoriser la nitrification, on fait circuler l'eau sur un « filtre » dont la surface fournit un support aux bactéries. À la fin du cycle, restent les nitrates qui servent de nourriture aux plantes, et qui en excès peuvent favoriser la prolifération des algues, voire s’avérer problématiques pour les poissons eux-mêmes..