ENSAIO LAMP

ENSAIO LAMP. BIOLOGIA MOLECULAR. Alunos: Bruno Campos Vera Valeska Guerra.

Conceito. A técnica LAMP ( Amplificação Isotérmica Mediada por loop) é uma técnica de biologia molecular desenvolvida em 1998 pela empresa japonesa Eiken Chemical Co . Ltd . É uma técnica molecular que amplifica fragmentos com alta especificidade, eficiência, precisão, baixo custo, rapidez (cerca de 30 minutos) e sob condições isotérmicas (de 60 a 65°C), por um mecanismo de deslocamento de fitas ( strand-displacement ). A RT-LAMP, combinação da RT com a LAMP, pode ser usada na detecção de vírus cujo material genético é o RNA. É um método rápido, preciso, sensível e mais barato que uma PCR, mas tem suas limitações..

A técnica consiste na síntese de DNA por autociclagem, utilizando a enzima Bst (isolada do Bacillus stearothermophilus com atividade de polimerase e transcriptase reversa) e um conjunto de dois pares de primers: internos: forward inner primer ( FIP ) e backwards inner primer ( BIP ) externos: forward 3 ( F3 ) e backwards 3 ( B3 ) Estes foram desenhados para reconhecer de maneira altamente específica seis sequências distintas no DNA alvo, sob uma temperatura constante de 65°C na maioria dos protocolos..

Principais componentes. Amostra do paciente com suspeita de uma infecção por vírus de RNA 2 ou 3 pares de oligonucleotídeos iniciadores ( primers ) específicos para a sequência de interesse, senso e antisenso. Enzimas transcriptase reversa e Bst DNA polimerase com atividade de helicase (da bactéria Geobacillus stearothermophilus ). Equipamento de temperatura, como termobloco, termociclador ou banho-maria. Fotômetro para a leitura do resultado da reação..

TRANSCRIGÄO AMPLIFICAGÄO DO LISE REVERSA cDNA LEITURA Positivo Negativo BIOMEDICINA PIDRÅo RNA cDNA.

Os primers da LAMP são complexos, altamente específicos e se anelam a sequências em diferentes regiões ao longo do DNA alvo: O forward inner primer (FIP) e o backwards inner primer (BIP) são longos (de 45 a 49 pares de bases) e formados por duas sequências distintas, sendo que o FIP contém a sequência F1c (complementar à F1) e a F2 (complementar à F2c), espaçadas por uma sequência TTTT; e o BIP, a sequência B1c (complementar à B1), o espaçador TTTT e a B2 (complementar à B2c). Os primers externos são as sequências F3 (complementar à F3c) e B3 (complementar à B3c), que são mais curtas (de 21 a 24 pares de bases) e aplicadas em concentrações menores na reação, para que elas se liguem à região alvo mais lentamente do que os primers internos. As características dos primers internos são as responsáveis pela maior especificidade da técnica..

Forward internal primer (FIP) Backward internal primer (BIP) Exponential Amplification.

Reação LAMP. A reação é dividida em três momentos: (1) produção inicial do alvo; (2) ciclagem e amplificação; (3) elongação e reciclagem.

1 - Produção inicial do alvo adição da enzima Bst e ação do primer interno FIP, que se anela à região F2c do DNA alvo; inicia a síntese da fita complementar; o primer externo F3 se hibridiza à região F3c no alvo e inicia a síntese de uma nova fita, separando as duas fitas anteriores; o mesmo processo acontece com os primers backwards BIP e B3; a liberação de uma delas acoplada ao FIP, resulta na formação de um loop em uma das suas pontas; após a ação desses quatro primers , o resultado é a fita de DNA com estruturas em loop nas duas pontas ( dumb-bell ); finalização da preparação inicial do alvo para a amplificação através da conversão da estrutura dumb-bell em stem -loop, através da ação do FIP novamente..

2 - Ciclagem e amplificação hibridação do FIP com a região do loop. Nesse momento, o FIP se anela à porção fita simples da estrutura stem-loop e dá início a uma nova síntese, liberando a fita gerada anteriormente, que, por sua vez, forma uma nova estrutura stemloop, que dá continuidade ao processo. Mais adiante, de forma semelhante, o BIP se anela à região alvo e também continua a amplificação.

3 - Elongação e reciclagem as reações de síntese por deslocamento de fitas são novamente mediadas pela Bst, a partir dos stem-loop e são sequencialmente repetitivas, exponencialmente produzindo inúmeros produtos de amplificação. os produtos finais não são cópias lineares de fita dupla ou simples do alvo, são de diferentes proporções, uns são estruturas stem-loop de DNA e outros são mais complexos, estruturas compostas por vários loops que se formam pelo anelamento de sequências copiadas invertidas 16 na mesma fita (estruturas em “formato de couve-flor”)..

and recycling Step J. Starting material prcxiucing step II. step.

a reação inteira acontece de forma isotérmica, não há a etapa de desnaturação da fita, sendo essa função realizada pela enzima Bst , que realiza a desnaturação de uma fita enquanto outra é formada, sem a necessidade de elevar a temperatura a 95°C. a reação acontece em menos de 1 hora e os ciclos da reação acumulam 109 cópias da sequência alvo, uma vez que o produto de um ciclo serve como substrato para a geração de novos produtos. Na PCR são produzidos cerca de um milhão de cópias. Pelo fato de a reação reconhecer o DNA alvo inicialmente por seis sequências e, nos estágios mais posteriores, por quatro sequências, é esperado que a amplificação seja de alta seletividade..

Com o avanço das pesquisas e aumento do interesse na técnica, foram desenvolvidas algumas variações: Amplificação Isotérmica Mediada por Loop de Transcrição Reversa (RT-LAMP) (possibilitada pela ação da enzima Bst) para sequências de RNA; LAMP multiplex; LAMP com visualização em real-time (com alteração do protocolo original).

a reação pode ser realizada em qualquer laboratório de biologia molecular, com uso de equipamentos simples (banho-maria ou banho seco, dispensando o uso de equipamentos caros, como termocicladores); tem duração de alguns minutos (30 minutos/1hora); com alta sensibilidade e seletividade da amplificação; não requer um template de DNA desnaturado para a amplificação; é menos sensível a inibidores de reação que a PCR; requer apenas uma enzima para a síntese de DNA; a detecção dos produtos pode ser feita a olho nu; vantajosa para trabalhos de campo e diagnósticos point-of-care (diagnóstico no próprio local de atendimento) na detecção de patógenos em cenários clínicos ou em hospitais, devido à sua velocidade e tempo reduzido de reação; identificação de espécies para o monitoramento genético de produtos alimentares comercializados e de amostras ambientais..

1 - O desenho dos seis primers espécie-específicos devem seguir rigorosos critérios de otimização: concentração; localização dos pares de nucleotídeos; distância entre regiões do DNA; primers devem apresentar estrutura de fita simples a 60 - 65°C, sem criarem uma fita dupla. Esses detalhes requerem atenção, porque o uso de múltiplos pares de primers para amplificar a mesma sequência pode aumentar o número de interações entre eles. Além disso, dependendo do alvo da pesquisa, para a escolha correta dos primers, deve ser feita uma análise entre a sequência selecionada e outras de organismos e espécies semelhantes e de proximidade filogenética com a espécie alvo, para verificar regiões flanqueadoras adequadas. Para isso, há disponíveis softwares próprios de suporte que simplificam o design apropriado dos primers..

2 - seus produtos de amplificação não podem ser aproveitados para futuras análises, como clonagem e sequenciamento, como os da PCR 3 - requer atenção a sua sensibilidade a possíveis contaminações cruzadas, por exemplo por partículas contidas no ar Atualmente, há inúmeros trabalhos desenvolvidos com o uso da LAMP como técnica de amplificação e esse número vem crescendo, principalmente nos últimos anos, devido à pandemia da Covid19, pois é um método de diagnóstico da infecção pelo SARS-Cov-2..

RT-LAMP RT vem de transcrição reversa, realizado pela enzima transcriptase reversa , que produz DNA complementar (cDNA) a partir de moléculas de RNA. A abreviação LAMP significa Amplificação Isotérmica Mediada por Loop : Amplificação : a enzima polimerase de alta eficiência amplifica a pequena quantidade de DNA alvo presente na amostra, gerando milhões de cópias da sequência. Isotérmica : a reação acontece numa única temperatura, geralmente entre 63 e 67°C. Mediada por loop : refere-se às estruturas em loop formadas no processo de amplificação, devido ao uso de primers específicos. Antes da amplificação, o cDNA é gerado e então a enzima DNA polimerase pode amplificá-lo..

Detecção do Produto. A leitura do resultado pode ser feita por: Turbidimetria - turbidez pelo acúmulo de pirofosfato. Mais simples e rápida Colorimetria - detecção de mudança de cor devido à adição de indicadores de pH, como o vermelho de fenol. Fluorescência - uso de agentes fluorescentes intercalantes de DNA, como o SYBR Green. Visualização real-time - devido à alta especificidade e grande quantidade de produtos gerados pela reação. Essa leitura pode ser qualitativa (positiva ou negativa) ou ser quantitativa (fazendo curva padrão)..

Um produto residual da LAMP é o pirofosfato de magnésio (Mg2P2O7), gerado enquanto os nucleotídeos são adicionados à nova cadeia de DNA sintetizada e depositado em suspensão ou sedimentado na solução da reação, possibilitando, assim, a sua visualização a olho nu. Portanto, se o tubo está opaco, houve a formação do produto residual, indicando presença de amplificação, enquanto que um tubo transparente, indica ausência de reação. O maior número de primers e regiões reconhecidas no DNA alvo são as características marcantes que definem a alta sensibilidade da LAMP em reconhecer um mínimo de seis cópias de DNA em toda a mistura da reação. É observada também uma maior resistência a backgrounds (fragmentos de DNA irrelevantes e agentes inibidores de reação), reduzindo as limitações em relação às outras técnicas de amplificação de ácidos nucleicos..

Fluorescéncia 11 12 3' eoeeoeoeeeoe 30 min 5' Colorimétrico A B c D 12 3 4 5 00000 ooeee 6 O 7 O 8 000 O 9 O 10 o 650C 700 UA — 700 UA.

Não há a necessidade da separação dos produtos por eletroforese com gel de agarose, com a utilização de corantes artificiais, no entanto, é possível utilizá-la para visualização. Em contraste com a PCR, os produtos da LAMP formam bandas de diferentes tamanhos e pesos moleculares, pois seus produtos são estruturas variadas . Essa é uma alternativa mais lenta e desgastante, com a possibilidade de contaminação cruzada das amostras, pela grande quantidade de amplicons gerados, não sendo, portanto, o método de detecção mais recomendado..

Protocolo. 1 - Extração da amostra O primeiro passo é fazer a extração do material genético que está sendo pesquisado presente na amostra do paciente. A lise das células, para expor o genoma viral, pode ser feita por reagentes químicos ou por calor, ou uma mistura dos dois. Esse processo dura cerca de 15 minutos. 2 - Transcrição reversa Para que a amplificação ocorra, a enzima transcriptase reversa deve converter a fita de RNA em fita simples de cDNA..

3 - Amplificação Geralmente ocorre entre 60 e 65°C, demora de 30 a 40 minutos e pode ser dividida em três etapas. 3.1- Produção inicial do alvo São produzidas as primeiras sequências de DNA com as estruturas em loop nas extremidades por meio do anelamento dos primers FIB ( forward inner primer ) e BIP ( backward inner primer ) e F3 e B3 que vão guiar a DNA polimerase. Como não há etapa de desnaturação da fita de DNA a 95°C, como ocorre na PCR, os primers F3 e B3 fazem esse papel guiando a DNA polimerase que também tem a atividade de deslocamento de fita. 3.2- Ciclagem e amplificação Os primers anelam-se novamente nas regiões específicas das sequências de DNA em loop já produzidas anteriormente. Os primers F3 e B3 já não são mais necessários..

3.3- Elongação e reciclagem As sequências de DNA alvo vão ficando ligadas umas às outras, formando estruturas maiores, longas e complexas, de tamanhos variados devido aos loops ..

Utilização do método. agricultura: possibilidade do diagnóstico rápido e eficiente de infecções vegetais e prevenção do espalhamento do patógeno em outras plantas saudáveis. Isso pode minimizar danos no comércio e transporte de produtos vegetais, bem como, ser aplicado no controle e monitoramento de doenças quarentenárias e não quarentenárias. medicina veterinária: detecção de patógenos para doenças de importância econômica, sanitária e epidemiológica: leishmaniose visceral e cutânea, infecção pelo vírus da Influenza A, subtipos H1, H5, H7 e H9; circovírus; vírus da bronquite infecciosa e polyomavirus hemorrágico de gansos em aves; doença da cabeça amarela em camarões; infecção por kobuvirus entérico suíno; toxoplasmose em gatos e cães, entre várias outras..

diagnóstico efetivo de COVID19 a partir de amostras de RNA extraído e diretamente de meios de transporte de vírus (swabs naso e orofaríngeos) sem extração. Isto se mostra extremamente útil para a realização de testes próximos a pacientes sintomáticos e para a triagem de pacientes assintomáticos. Após a escolha do marcador molecular, o principal desafio para uma reação altamente eficiente de LAMP é o design do conjunto de primers espécie-específicos, que devem se adequar a critérios rigorosos: concentração; porcentagem de G/C; localização dos pares de nucleotídeos; distância entre regiões do DNA e primers não devem criar uma estrutura de fita dupla a 60 - 65°C deve ser feita uma escolha de regiões de anelamento de primers na extremidade 3’ de F3; F2; B2 e B3 e na 5’ de F1c eB1c que garantam suficientes incompatibilidades entre a espécie alvo e as não-alvo.

Quais são as semelhanças e diferenças entre o RT-LAMP e o RT-PCR? 1. Coleta e material analisado Ambos utilizam amostras de secreção da nasofaringe ou saliva, com indução de reações para a realização de transcrição reversa (RT) e uma fase de amplificação, na qual regiões específicas do SARS-CoV-2 são replicadas milhões de vezes. Esses exames, portanto, detectam o material genético do vírus. É desta forma que os dois exames apontam, por meio de um resultado detectável ou não detectável, se o indivíduo está ou não com a COVID-19. 2. Sensibilidade, especificidade e acurácia A RT-LAMP é considerada análoga ao RT-PCR isso porque os parâmetros deste exame são muito semelhantes ao RT-PCR. 3. Tempo para entrega do resultado Enquanto um exame de RT-PCR demora de 2 a 3 dias para ficar pronto, o RT-LAMP oferece um resultado em até 1h..

consiste em cadastrar o paciente: dados pessoais, responder um questionário rápido com algumas perguntas sobre o início dos sintomas. coleta da amostra de secreção da nasofaringe ( Swab flocked de nylon), que permite mais conforto ao paciente. a amostra é dissolvida no tubo de extração que é colocado dentro do Hilab Molecular. Nesta etapa, o capsídeo viral é rompido para que o material genético do vírus fique disponível na amostra. na etapa de reação, o RNA viral é transformado em DNA. Regiões específicas do vírus são replicadas milhões de vezes para que o SARS-CoV-2 seja identificado na amostra. o dispositivo usa as amostras de controle positivo, negativo e interno para validar a reação, que é enviada ao laboratório via internet e analisada por profissionais de saúde do laboratório de análises clínicas. o paciente recebe o laudo assinado por SMS ou e-mail em até 1h..

Quando realizar o RT-LAMP? O exame PCR-LAMP é um exame confirmatório e apresenta uma ampla janela de detecção ideal para identificar pessoas infectadas, inclusive assintomáticas. A sua realização é indicada do 3º ao 15º dia após a exposição ou do 1º ao 10º dia após o início dos sintomas. Como interpretar o exame RT-LAMP? O exame RT-LAMP é qualitativo. São dois os possíveis resultados: Não detectável: possível ausência de infecção pelo coronavírus. No entanto, falsos-negativos são possíveis, principalmente se a amostra foi coletada em uma fase muito precoce ou tardia da infecção. - Detectável: possível infecção pelo coronavírus: material genético do vírus detectado na amostra analisada..

Referências Bibliográficas. MORI Y, NOTOMI T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J Infect Chemother. 2009;15(2):62-69. doi:10.1007/s10156-009-0669-9 - Universo da Biologia Molecular. LAMP: Loop-mediated isothermal amplification ( link ). - NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63. doi:10.1093/nar/28.12.e63 - HABIBZADEH P et al. Molecular diagnostic assays for COVID-19: an overview. Crit Rev Clin Lab Sci. 2021;58(6):385-398. doi:10.1080/10408363.2021.1884640 - LEIN A L C LEIN. Amplificação isotérmica mediada por loop para identificação de espécies de peixes. Universidade Estadual Paulista - Bauru. 2022.